慢病毒介導(dǎo)的RNAi沉默RhoA基因?qū)θ寺殉舶┘毎忠u轉(zhuǎn)移影響的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　侵襲性和轉(zhuǎn)移性是惡性腫瘤的重要標(biāo)志,事實上,當(dāng)發(fā)現(xiàn)腫瘤原發(fā)病灶時,腫瘤細胞已以微小克隆的形式發(fā)生了全身性的播散,成為腫瘤復(fù)發(fā)的種子。在女性惡性腫瘤中,卵巢癌病死率位于首位,嚴(yán)重威脅婦女的身心健康,由于發(fā)病隱匿,早期缺乏特異性癥狀與體征,迄今仍缺乏早期診斷方法,確診時60％～70%的患者已屬晚期,在手術(shù)或聯(lián)合化療后仍有50%～80%的患者復(fù)發(fā)。所以,侵襲和轉(zhuǎn)移是卵巢癌治愈困難的瓶頸所在,深入了解其發(fā)生的分子機制,能為

2、卵巢癌的治療提供理論依據(jù)。
　　腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個涉及多種癌基因和抑癌基因改變的復(fù)雜的病理現(xiàn)象,其中RhoA(Ras homologue member A)基因參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個重要過程,它通過調(diào)控細胞的形態(tài)和運動的能力參與腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,因而成為近期研究的熱點。RNAi(RNA interference,RNAi)是近幾年發(fā)展起來的新技術(shù),原理是內(nèi)源性或外源性小干擾RNA(small interfering RN

3、A,siRNA)在生物體內(nèi)引起同源靶基因的mRNA的序列特異性沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)過程,屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默,RNAi技術(shù)由于其高效性和特異性成為目前基因沉默的首選工具,然而如何更好地將其優(yōu)勢發(fā)揮到臨床生物治療卻是個難題。本實驗通過構(gòu)建慢病毒載體,采用RNAi技術(shù)沉默rhoA基因的表達,研究RhoA基因在卵巢癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的作用機制,以期為卵巢癌的靶向治療提供理論

4、依據(jù)。
　　研究目的：
　　本研究以人卵巢癌細胞HO8910為模型,通過包裝針對RhoA基因的shRNA慢病毒干擾載體,建立RhoA基因穩(wěn)定沉默卵巢癌細胞株,通過體外實驗研究沉默RhoA基因?qū)β殉舶┘毎忠u和轉(zhuǎn)移的影響。
　　研究方法：
　　1、高表達RhoA基因的人卵巢癌細胞株的篩選
　　采用Western blot法在蛋白水平上檢測四種不同轉(zhuǎn)移潛能人卵巢癌細胞株HO8910、ES-2、SKOV3和OVC

5、AR3細胞中RHOA蛋白的表達情況,從而篩選出高表達人RhoA蛋白的卵巢癌細胞株進行后續(xù)實驗。
　　2、RhoA-shRNA真核表達載體的構(gòu)建、鑒定及高干擾效率片段的篩選
　　使用公用網(wǎng)站設(shè)計、篩選符合相關(guān)參數(shù)的序列3條,由上海吉凱基因技術(shù)有限公司合成。與psiHIV-U6質(zhì)粒重組后,轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌,陽性克隆經(jīng)過PCR鑒定以及DNA測序鑒定后,提取重組質(zhì)粒;利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293T細胞,通過實時熒光定量PCR法檢測3條序列

6、的干擾效率,篩選出高干擾效率片段進行慢病毒包裝及后續(xù)實驗。
　　3、慢病毒RhoA-shRNA-sh/NC-LV的制備、感染細胞HO8910及穩(wěn)定克隆的建立
　　在293T細胞中進行慢病毒的包裝、收集及滴度的測定,慢病毒感染人卵巢癌細胞,通過嘌呤霉素穩(wěn)定篩選及擴大培養(yǎng),獲得RhoA基因穩(wěn)定沉默的卵巢癌細胞株,熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,采用實時熒光定量PCR和western blot法分別從mRNA及蛋白水平檢測穩(wěn)定克隆中Rho

7、A基因的表達。
　　4、沉默RHOA基因?qū)β殉舶┘毎忠u和轉(zhuǎn)移能力的影響
　　利用細胞計數(shù)及MTT實驗從細胞數(shù)量和細胞存活率上描述細胞生長狀況;采用黏附實驗檢測細胞的黏附能力。采用細胞劃痕實驗、Transwell侵襲及遷移實驗檢測細胞的體外侵襲及遷移能力;采用體外血管形成實驗檢測細胞誘導(dǎo)血管形成的能力。
　　結(jié)果：
　　1、成功篩選出高表達基因的卵巢癌細胞株:HO8910細胞株.
　　2、成功構(gòu)建了針對Rh

8、oA基因三個不同位點的RNAi真核質(zhì)粒,經(jīng)酶切和測序鑒定與實驗設(shè)計合成的RhoA靶基因序列完全一致;將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞后,實時熒光定量PCR結(jié)果顯示psiHIV-U6-RhoA-sh1/2/3均可產(chǎn)生干擾效果,以psiHIV-U6-RhoA-sh2效果最佳。
　　3、成功包裝慢病毒RhoA-shRNA-sh-LV、RhoA-shRNA-NC-LV,將其感染卵巢癌細胞,經(jīng)嘌呤霉素加壓篩選后,實時熒光定量PCR及Western

9、 blot檢測,結(jié)果顯示,干擾組細胞中RhoAmRNA和蛋白的相對表達率分別為(30.70±5.40)%、(32.08±5.46)%,通用陰性對照組為(95.90±6.53)%、(60.58±6.21)%,H08910組為(100.0±4.37)%、(59.25±4.52)%,干擾組與其他兩組對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),表明成功構(gòu)建了RhoA基因穩(wěn)定沉默卵巢癌細胞株。
　　4、人RhoA基因穩(wěn)定沉默卵巢癌細胞株的體外增殖