麻疹核蛋白基因在大腸桿菌和家蠶中的表達(dá)及鑒定.pdf

1、麻疹是由麻疹病毒(Measles Virus，MV)通過飛沫傳播引起的一種以出疹、發(fā)熱為主要臨床表現(xiàn)的急性呼吸道傳染病。麻疹病毒屬副粘病毒科麻疹病毒屬，為單股負(fù)鏈RNA病毒，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，從3'端到5'端分別次序?yàn)?核蛋白(N)、磷蛋白(P)、內(nèi)膜蛋白(M)、血溶素蛋白(F)、血凝素蛋白(H)以及RNA聚合酶(L)，各基因的起始序列與終止序列都含有與mRNA的合成與加工有關(guān)系的共有序列。
　　 近年的研究發(fā)現(xiàn)，在麻疹病毒的6

2、個(gè)結(jié)構(gòu)基因中，核蛋白(N)基因和血凝素(H)基因變異最大，N基因C末端450個(gè)核苷酸為該病毒最大變異區(qū)。在不同的麻疹野毒株之間最高變異程度可達(dá)12％，故N基因是國(guó)際上公認(rèn)對(duì)麻疹毒株鑒定的重要指標(biāo)。在麻疹病毒感染的急性期會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫，在所有結(jié)構(gòu)蛋白中，核蛋白最早刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)。
　　 目前麻疹檢測(cè)方法主要有血清學(xué)檢測(cè)和病原學(xué)檢測(cè)，臨床采用的檢測(cè)方法一般直接利用麻疹全病毒作為抗原，存在分離困難和生物安全

3、的問題。本研究試圖通過表達(dá)重組蛋白獲得具有一定抗原性的麻疹核蛋白，代替麻疹全抗原檢測(cè)人群IgG抗體。為此，本試驗(yàn)選取麻疹病毒的核蛋白進(jìn)行研究，通過成功表達(dá)麻疹核蛋白并檢測(cè)其基本的抗原性，為開發(fā)快速、特異的麻疹血清抗體檢測(cè)試劑奠定了基礎(chǔ)。
　　 本文以NCBI中麻疹病毒基因序列（GenBank: DQ211902.1）為基礎(chǔ)，選取麻疹病毒核蛋白基因，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增核蛋白基因并連接到克隆載體。為更好適應(yīng)大腸桿菌表達(dá)，將該目的片段

4、分為兩個(gè)小片段（A段40bp-873bp，B段739bp-1536bp）連接到原核表達(dá)載體pET28a(+)，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-MV-NA/NB，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21(DE3)，重組大腸菌于37℃0.5mmol/LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h后，該菌體裂解物經(jīng)SDS-PAGE分析，在分子量約為30 kDa和29kDa處分別出現(xiàn)一條特異性蛋白條帶，與預(yù)期的目的蛋白分子質(zhì)量相符。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示麻疹核蛋白基因在大腸

5、桿菌中表達(dá)成功，將重組蛋白按不同的量包被進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)其抗原性，結(jié)果顯示，兔免疫血清結(jié)果良好，而人免疫血清出現(xiàn)非特異性，P/N＜2.1，因而該重組蛋白不適合用于麻疹病毒人免疫血清學(xué)檢測(cè)。
　　 將麻疹核蛋白基因序列定向連接到真核表達(dá)時(shí)所用轉(zhuǎn)載移體pVL1393上，鑒定后得到重組質(zhì)粒pVL-MV-N，將病毒Bm-BacPAK6 DNA進(jìn)行線性化處理后，與pVL-MV-N共轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞。成功發(fā)生同源重組