MiR-34a通過Wnt-β-catenin信號(hào)通路影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖及凋亡.pdf

1、目的:
　　應(yīng)用文獻(xiàn)檢索和生物信息庫(kù)預(yù)測(cè),尋找miR-34a參與調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路的線索。通過分子生物學(xué)技術(shù)在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SK-N-SH細(xì)胞)中過表達(dá)miR-34a,而后檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性的變化,以及腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的情況。為闡明miR-34a和Wnt/β-catenin信號(hào)通路在神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)病機(jī)制中的作用提供依據(jù),也為進(jìn)一步研究神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)生的分子機(jī)制和基因治療方法提供新的

2、思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、檢索相關(guān)文獻(xiàn)資料并應(yīng)用生物信息學(xué)方法——靶基因預(yù)測(cè)軟件(PicTar、Target Scan、microRNA.org、RNA22)預(yù)測(cè)并分析可能調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路的microRNA,同時(shí)預(yù)測(cè)miR-34a潛在的靶基因。
　　2、構(gòu)建miR-34a的模擬物并將其轉(zhuǎn)入SK-N-SH細(xì)胞中,再以半定量反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、熒光定量PCR(Real-time

3、PCR)檢測(cè)miR-34a在細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　3、在SK-N-SH細(xì)胞中過表達(dá)miR-34a后,蟲熒光素報(bào)告實(shí)驗(yàn)分析Wnt1和catenin-δ-1的mRNA轉(zhuǎn)錄活性,以及β-catenin/TCF的轉(zhuǎn)錄活性;蛋白免疫印記法(Western-blot)檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白(Wnt1、β-catenin、Cyclin D)的表達(dá)水平;免疫共聚焦顯微鏡觀察β-catenin核轉(zhuǎn)位情況。
　　4、

4、在SK-N-SH細(xì)胞中過表達(dá)miR-34a后,采用MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖情況,并運(yùn)用流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果:
　　1、經(jīng)過文獻(xiàn)查閱以及PicTar、Target Scan、microRNA.org、RNA22四種軟件共同預(yù)測(cè),miR-34a可能參與調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路,catenin-δ-1為miR-34a潛在靶基因。
　　2、RT-PCR及Real-time PCR證實(shí)構(gòu)建的miR-

5、34a模擬物能使miR-34a在SK-N-SH細(xì)胞中過表達(dá)。
　　3、在SK-N-SH細(xì)胞中過表達(dá)miR-34a后Wnt1和catenin-δ-1的mRNA轉(zhuǎn)錄活性,以及β-catenin/TCF的轉(zhuǎn)錄活性均受到抑制;Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白(Wnt1、β-catenin、Cyclin D)的表達(dá)水平下降;同時(shí),β-catenin的核轉(zhuǎn)位也受阻。
　　4、在SK-N-SH細(xì)胞中過表達(dá)miR-34a后,腫瘤

6、細(xì)胞增殖水平下降,細(xì)胞凋亡增多。以對(duì)照組SK-N-SH細(xì)胞為參照,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在第24h、48h和72h的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為40.8％、20.9%和18.2%;實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在第24h、48h和72h的細(xì)胞凋亡率分別為對(duì)照組的2.09、2.25和1.77倍。
　　結(jié)論:
　　在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SK-N-SH細(xì)胞)中過表達(dá)miR-34a,miR-34a可以通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路的經(jīng)典途徑,抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)