流感病毒感染神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞條件上清的免疫生物學(xué)效應(yīng).pdf

1、1.背景和目的：
　　流感急性腦病（influenza acute encephalopathy，IAE）是流感病毒感染的重要并發(fā)癥之一，患者在病毒感染后在呼吸道癥狀出現(xiàn)1-2天內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀，表現(xiàn)為快速發(fā)展的認(rèn)知障礙、精神狀態(tài)改變、意識消退、昏迷等，嚴(yán)重時引起神經(jīng)后遺癥或死亡。目前， IAE的發(fā)病機(jī)制依然不明。在流感急性腦病病人的腦脊液(CSF)和血漿中，發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1等促炎癥細(xì)胞因子的濃度升高。認(rèn)為流感急性腦病

2、可能是因機(jī)體在感染流感病毒后釋放促炎癥因子，進(jìn)而誘導(dǎo)了細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)，造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)發(fā)生以促炎癥因子和趨化因子過度釋放為特征的細(xì)胞因子風(fēng)暴（cytokinne storm），引發(fā)神經(jīng)及免疫系統(tǒng)功能紊亂和CNS的免疫病理損傷[1-3]。
　　我們前期研究發(fā)現(xiàn)流感病毒可以感染星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，并造成大量促炎細(xì)胞因子和趨化因子釋放。而由流感病毒感染膠質(zhì)細(xì)胞所釋放的大量細(xì)胞因子對正常膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)功能有何影響尚未見報

3、道。因此，本研究利用人流感病毒H1N1和H3N2感染小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞獲得條件上清，利用條件上清刺激正常星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，檢測相關(guān)促炎細(xì)胞因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄水平變化，及TNF-α,IL-6,IL-1β的蛋白表達(dá)水平變化，為研究IAE所伴隨的細(xì)胞因子級聯(lián)放大及細(xì)胞因子風(fēng)暴提供依據(jù)。
　　2.方法：
　　2.1 A/Puerto Rico/8/34(H1N1)和A/Shantou/602/2006(H3N2)流感病毒株在

4、MDCK細(xì)胞系中的增殖、保存及病毒滴度的測定。
　　2.2原代BALB/C小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)，利用間接免疫熒光法鑒定細(xì)胞純度。
　　2.3不同亞型流感病毒株(H1N1,H3N2)感染星型膠質(zhì)細(xì)胞(MOI=2)，感染6h、24h后，收獲細(xì)胞上清液。
　　2.4利用超濾分子截留技術(shù)(截留分子量為300kD)，對細(xì)胞上清液進(jìn)行超濾，獲得條件上清液。
　　2.5流感病毒血凝實(shí)驗(yàn)檢測處理后的條件上清液中流感

5、病毒顆粒。
　　2.6 CCK8法檢測條件上清液對原代BALB/C小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞活性的影響。
　　2.7條件上清液分別刺激原代BALB/C小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，24h后提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。RealTime PCR法檢測促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6，趨化因子IP-10、MCP-1、MIP-1轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　2.8條件上清刺激原代BALB/C小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，E

6、LISA法檢測不同時間點(diǎn)細(xì)胞上清液中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白含量，Western Blotting法檢測GFAP蛋白的表達(dá)情況。
　　2.9條件上清液刺激原代BALB/C小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，Trans well法檢測小膠質(zhì)細(xì)胞遷移情況。
　　3.結(jié)果：
　　3.1通過間接免疫熒光鑒定，成功完成對原代BALB/C小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞純度達(dá)95％以上。
　　3.2利用空斑法檢測

7、，H1N1和H3N2流感病毒滴度為1×107PFU/ml。
　　3.3通過血凝實(shí)驗(yàn)檢測，條件上清液中無法檢測到流感病毒顆粒。
　　3.4 RealTime PCR結(jié)果表明，條件上清液分別刺激原代BALB/C小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞24h后,皆可誘導(dǎo)正常膠質(zhì)細(xì)胞的促炎癥因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生不同程度的上調(diào)。
　　3.5 CCK-8檢測結(jié)果表明，條件上清液分別刺激原代BALB/C小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞24h

8、后，與對照組比較，刺激組細(xì)胞活性被抑制。
　　3.6 Western Blotting法檢測結(jié)果表明，條件上清液刺激原代BALB/C小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞后， GFAP蛋白表達(dá)水平發(fā)生上調(diào)。
　　3.7 ELISA法檢測結(jié)果表明，條件上清液刺激原代BALB/C小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞后，促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6在不同時間點(diǎn)的蛋白表達(dá)水平發(fā)生不同程度改變,總體呈下降趨勢。
　　3.8 Trans well法檢測結(jié)果

9、表明，條件上清刺激原代BALB/C小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞24h后，小膠質(zhì)細(xì)胞遷移率未發(fā)生上調(diào)。
　　4.結(jié)論：
　　4.1流感病毒感染星形膠質(zhì)細(xì)胞條件上清液分別刺激原代BALB/C小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞后,皆可誘導(dǎo)正常膠質(zhì)細(xì)胞的促炎癥因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生不同程度的上調(diào)，產(chǎn)生細(xì)胞因子級聯(lián)效應(yīng)。
　　4.2流感病毒感染星形膠質(zhì)細(xì)胞條件上清液分別刺激原代BALB/C小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞后,皆可抑制細(xì)胞活性。