巴戟天糖鏈促血管生成及血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 近年來(lái),缺血性心臟病發(fā)病率逐年上升,全世界發(fā)病率為2％。心肌梗死(myocardial infarction,MI)是目前嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一,而慢性心功能衰竭(chronic heart failure,CHF)是MI致死的主要原因之一。分子搭橋術(shù)(molecular bypass,又名治療性血管新生therapeutic angiogensis)為缺血性損傷的心肌細(xì)胞及衰竭的心肌細(xì)胞功能恢復(fù)提供

2、了一種全新的治療策略。分子搭橋術(shù),即通過(guò)一些方法的刺激包括某些藥物的治療作用在病損心肌區(qū)域增加功能性(治療性)的冠狀動(dòng)脈分支或側(cè)支,以達(dá)到恢復(fù)缺血心肌血供,改善患者癥狀和預(yù)后的目的。近十年的研究結(jié)果證實(shí),分子搭橋能幫助機(jī)體建立有效的側(cè)支循環(huán),從根本上緩解心肌缺血癥狀,改善病情,從而分子搭橋已經(jīng)成為目前世界心血管醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題。因此,深入研究分子搭橋的內(nèi)在機(jī)制以及開(kāi)發(fā)有效的促進(jìn)分子搭橋藥物,必將極大的提高缺血性心臟病人的生活質(zhì)量和壽命

3、長(zhǎng)度。本導(dǎo)師組近年來(lái)一直致力于巴戟天糖鏈(Morinda officinalisoligosaccharides,MOO)保護(hù)心臟作用的研究,前期的研究已證實(shí):MOO具有明顯的減輕缺氧復(fù)氧或缺血再灌注對(duì)心肌細(xì)胞的損傷；可以促進(jìn)雞胚絨毛尿囊及大鼠缺血心肌中血管的生成；增加其微血管(MVD)的數(shù)量及密度；顯著上調(diào)與血管新生相關(guān)的VEGF、bFGF蛋白的表達(dá)；血管生成基因芯片結(jié)果顯示MOO可顯著上調(diào)多種促血管生成基因mRNA的表達(dá),下調(diào)多種抑

4、制血管生成基因mRNA的表達(dá)；MOO可劑量依賴性的提高血管細(xì)胞中TRPC6蛋白的表達(dá)。因此,本實(shí)驗(yàn)以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)為研究對(duì)象,采用血管內(nèi)皮遷移和小管生成實(shí)驗(yàn)觀察MOO對(duì)缺氧復(fù)氧損傷內(nèi)皮細(xì)胞遷移及管腔樣結(jié)構(gòu)的形成的影響,采用流式細(xì)胞儀技術(shù)觀察缺氧復(fù)氧損傷后各組細(xì)胞的增殖情況,旨在進(jìn)一步觀察MOO促血管生成效應(yīng),并為其在缺血心肌保護(hù)及促進(jìn)缺血心臟建立側(cè)枝循環(huán)方面的作用提供更加直觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 1 HUVEC細(xì)胞

5、的培養(yǎng)
　　 HUVEC細(xì)胞接種到50ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng),加入含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,在37℃,5％CO2,飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d,細(xì)胞逐漸長(zhǎng)成單層融合狀。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞核圓,核膜清晰,細(xì)胞呈梭形多邊狀,表現(xiàn)為典型鋪路石樣。當(dāng)培養(yǎng)瓶長(zhǎng)滿80％左右即可用胰蛋白酶消化傳代或凍存。
　　 2細(xì)胞模型的制作與確定
　　 種板培養(yǎng)24h后,各孔棄去培養(yǎng)基,用無(wú)糖Earle's液洗細(xì)胞2次,正常對(duì)

6、照組加入1640培養(yǎng)基；模型組加入含連二亞硫酸鈉終濃度為1mM的無(wú)糖Earle's液,造成細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷,陽(yáng)性藥對(duì)照組加入麝香保心丸(2 g·L-1),MOO各組加入含連二亞硫酸鈉終濃度為1mM的無(wú)糖Earle's液及MOO大(0.45 g·L-1)、中(0.15 g·L-1)、小(0.05 g·L-1),37℃孵育4h；取出培養(yǎng)板,吸棄各實(shí)驗(yàn)孔液體,用無(wú)糖Earle's液洗細(xì)胞2次,各實(shí)驗(yàn)孔均換含藥的無(wú)血清1640培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)1

7、2h,造成細(xì)胞復(fù)氧損傷。
　　 3實(shí)驗(yàn)分組
　　 本實(shí)驗(yàn)分為六組:
　　 ①正常細(xì)胞組
　　 ②缺氧復(fù)氧損傷模型組
　　 ③缺氧復(fù)氧損傷模型+陽(yáng)性對(duì)照藥麝香保心丸組(2g／L)
　　 ④缺氧復(fù)氧損傷模型+小劑量MOO組(0.05g／L)
　　 ⑤缺氧復(fù)氧損傷模型+中劑量MOO組(0.15g／L)
　　 ⑥缺氧復(fù)氧損傷模型+大劑量MOO組(0.45g／L)
　　 4觀

8、察指標(biāo)
　　 正常培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞3～8代,制作缺氧復(fù)氧損傷模型,給予不同劑量MOO干預(yù)12h,①倒置顯微鏡觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)；②流式細(xì)胞儀檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況；③觀察在缺氧復(fù)氧條件下各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移狀況；④觀察在缺氧復(fù)氧條件下各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的小管形成狀況。
　　 5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS16.0。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。檢驗(yàn)結(jié)果均取a=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)

9、。組間比較采用單因素方差分析,當(dāng)差異有顯著意義時(shí)進(jìn)一步用q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。
　　 結(jié)果:
　　 1損傷4h后,鏡下可見(jiàn)模型組細(xì)胞收縮變圓,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,間隙明顯變大,并有部分脫落。
　　 2流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:與正常組相比,缺氧復(fù)氧模型組增加了G2+S期的細(xì)胞,與模型組相比,MOO大、中劑量減弱了這種趨勢(shì),使細(xì)胞狀態(tài)更接近于正常細(xì)胞,小劑量的MOO的作用不明顯。
　　 3與缺氧復(fù)氧損傷模型組對(duì)比,