肝再生磷酸酶-3在肝內(nèi)膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究.pdf

1、[研究背景與目的]:
　　 肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)也稱(chēng)為外周型膽管癌、膽管癌之肝內(nèi)型,是肝內(nèi)膽管被覆上皮發(fā)生的、起源于肝內(nèi)二級(jí)分支以下膽管上皮的一種原發(fā)性肝癌。世界范圍內(nèi)統(tǒng)計(jì),肝內(nèi)膽管癌約占原發(fā)性肝臟惡性腫瘤的10％～15％,但近年來(lái)肝內(nèi)膽管癌發(fā)病率不斷增長(zhǎng)。肝內(nèi)膽管癌具有發(fā)生隱匿、惡性程度高、發(fā)展迅速、容易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn),盡管診斷治療方面已取得巨大進(jìn)步,但肝內(nèi)膽管癌

2、預(yù)后仍然很差。與肝細(xì)胞肝癌相比,肝內(nèi)膽管癌容易發(fā)生早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,而且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響肝內(nèi)膽管癌預(yù)后的重要因素。因此,早期防止淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是改善肝內(nèi)膽管癌患者預(yù)后的重要措施。
　　 肝再生磷酸酶(phosphatase of regenerating liver,PRLs)是PTP酶家族重要成員之一,該基因家族包括PRL-1,PRL-2,PRL-3三個(gè)成員,它們分別定位在6q12,1p35,8q24.3染色體上。三個(gè)成員皆為分子量

3、20KD左右的小分子蛋白,彼此之間的同源性高達(dá)76％～87％。PRLs家族體內(nèi)和體外可以被異戊二烯化,這種翻譯后修飾對(duì)PRL細(xì)胞內(nèi)定位很重要。在其羧基端被異戊二烯基化后,PRL分布于胞漿膜上；在游離狀態(tài)下,定位于細(xì)胞核中。越來(lái)越多的證據(jù)表明PRLs,尤其是PRL-3在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、分化及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中起了重要作用。
　　 PRL3是最近發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。最初研究發(fā)現(xiàn) PRL-3與結(jié)直腸腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān),PRL-3在結(jié)直腸癌

4、轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá),在非轉(zhuǎn)移性原發(fā)灶和正常黏膜上皮中呈低表達(dá)。此后,陸續(xù)研究表明PRL-3在胃癌、乳腺癌及卵巢癌轉(zhuǎn)移灶中也高表達(dá),并且與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)。一些證據(jù)表明PRL3過(guò)表達(dá)是腫瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移特性的關(guān)鍵改變點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞中PRL-3高表達(dá),體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移遷移侵襲,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)裸鼠轉(zhuǎn)移瘤形成；相反,通過(guò)RNA干擾技術(shù)下調(diào)內(nèi)源性PRL-3的表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞遷移侵襲并減緩裸鼠轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)。此外,研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者P

5、RL-3過(guò)表達(dá)與患者預(yù)后負(fù)相關(guān)。PRL-3過(guò)表達(dá)的腫瘤患者生存期相對(duì)較短,這點(diǎn)已在胃癌、直腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中有報(bào)道。由此可見(jiàn),PRL-3在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能起重要作用,并有望成為評(píng)價(jià)腫瘤患者的預(yù)后標(biāo)志。
　　 但是,目前尚無(wú)PRL-3在肝內(nèi)膽管癌中表達(dá)情況的報(bào)道,其在肝內(nèi)膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用尚不明確。本研究通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)PRL-3在肝內(nèi)膽管癌原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)情況,并分析其表達(dá)與臨床病理特征包括預(yù)后的關(guān)系。

6、同時(shí)借助于RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù),以合成的PRL-3基因小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)轉(zhuǎn)染處理肝內(nèi)膽管癌HCCC-9810細(xì)胞,觀察PRL-3 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響,并進(jìn)一步探討PRL-3參與侵襲轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。
　　 [方法]:
　　 1.免疫組化方法檢測(cè) PRL-3在肝內(nèi)膽管癌中的表達(dá):選取病例科存檔且臨床資料完整的1

7、02例肝內(nèi)膽管癌原發(fā)灶及癌旁組織和相應(yīng)62例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶,應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)PRL-3表達(dá),分析PRL-3表達(dá)與肝內(nèi)膽管癌患者臨床病理特征的關(guān)系。生存分析方法評(píng)價(jià)PRL-3表達(dá)對(duì)肝內(nèi)膽管癌患者預(yù)后的影響。
　　 2.PRL-3 siRNA體外合成及對(duì)HCCC-9810細(xì)胞的干預(yù):培養(yǎng)人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株 HCCC-9810,檢測(cè)細(xì)胞株中PRL-3的表達(dá)。體外化學(xué)方法合成三條 PRL-3特異性 siRNA、陰性對(duì)照siRNA；通過(guò)

8、脂質(zhì)體Lipofectamine2000將siRNA轉(zhuǎn)染入肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞HCCC-9810,并篩選出最有效的干擾片段。采用RT-PCR、western-blot分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HCCC-9810中 PRL-3基因和蛋白的表達(dá)情況,評(píng)價(jià)干擾效果。
　　 3.PRL-3對(duì)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及機(jī)制探討:細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(Scratch wound-healing assays)檢測(cè) PRL-3干擾前后細(xì)胞遷移能力變化。Tran

9、swell體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè) PRL-3干擾前后細(xì)胞侵襲能力變化。Westernblot方法檢測(cè) PRL-3 siRNA轉(zhuǎn)染后MMP-7,MMP-9表達(dá)情況,探討 PRL-3促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。
　　 [結(jié)果]:
　　 1.PRL-3在肝內(nèi)膽管癌中的表達(dá):PRL-3在癌旁正常膽管組織、肝內(nèi)膽管癌原發(fā)
　　 灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中陽(yáng)性表達(dá)率依次升高,分別為0,47.1％(48/102)和80.6％(50/62),三組

10、間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,兩兩相比也有顯著差異(P<0.05):且伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移原發(fā)灶的表達(dá)陽(yáng)性率(61.3％)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶(25.0％),兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。PRL-3表達(dá)與TNM分期(P<0.001),T分級(jí)(P<0.001),血管侵犯(P=0.002),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)及CA-199水平(P<0.05)相關(guān)。生存分析(Kaplan-Meier方法)顯示PRL-3表達(dá)與預(yù)后負(fù)相關(guān),PR

11、L-3高表達(dá)的肝內(nèi)膽管癌患者總體生存率低于PRL-3表達(dá)低的患者。Cox模型多因素分析表明PRL-3表達(dá)水平是肝內(nèi)膽管癌患者獨(dú)立的預(yù)后標(biāo)志(RR1.886,P=0.024)。
　　 2.小干擾RNA轉(zhuǎn)染:RT-PCR和Western blot的方法分別在mRNA和蛋白水平檢測(cè)到PRL-3在HCCC-9810肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株高表達(dá),為RNA干擾提供理論依據(jù)。通過(guò)脂質(zhì)體Lipofectamine2000分別將特異性PRL-3 siR

12、NA和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染入肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞HCCC-9810。RT-PCR和Western blot檢測(cè)干擾效果?？瞻讓?duì)照HCCC-9810組、陰性對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組及PRL-3 siRNA1、2、3組PRL-3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為:0.596±0.106、0.581±0.045、0.651±0.055、0.183±0.085、0.197±0.058和0.396±0.086；相對(duì)應(yīng)各組PRL-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為:0.6

13、53±0.077、0.589±0.049、0.611±0.066、0.071±0.018、0.059±0.024和0.280±0.101。結(jié)果顯示三條PRL-3siRNA都能有效下調(diào)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞HCCC-9810內(nèi)源性PRL-3表達(dá),特別是PRL-3siRNA-2抑制效果更強(qiáng),我們選用PRL-3siRNA-2進(jìn)行侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)。與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA組、脂質(zhì)體對(duì)照組和空白對(duì)照組相比,RT-PCR和Western blot結(jié)果均顯示轉(zhuǎn)

14、染PRL-3特異性siRNA-2組PRL-3表達(dá)明顯降低(P<0.05),而轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA組、脂質(zhì)體對(duì)照組和空白對(duì)照組PRL-3表達(dá)幾乎無(wú)明顯差別,實(shí)驗(yàn)各組的內(nèi)參表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　 3.PRL-3對(duì)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制探討:細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果:PRL-3siRNA-2組在劃痕培養(yǎng)24h后劃痕區(qū)域?qū)挾日汲跏紕澓蹍^(qū)域?qū)挾鹊陌俜直葹?62.12±6.28)％,陰性對(duì)照組為(23.88±2.55)％,空白對(duì)照HC

15、CC-9810組為(21.20±6.07)％。PRL-3siRNA-2組細(xì)胞的劃痕兩端距離相比明顯較寬,分別與陰性對(duì)照組細(xì)胞和空白對(duì)照HCCC-9810組細(xì)胞相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),后兩者無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；說(shuō)明 PRL-3 SiRNA-2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移能力明顯減弱。Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PRL-3SiRNA-2組細(xì)胞侵襲能力明顯減弱,穿膜細(xì)胞數(shù)為(19.40±2.30)個(gè)/HP,明顯少于陰性

16、對(duì)照組(64.00±2.73)個(gè)/HP和正常 HCCC-9810組(67.20±3.11)個(gè)/HP,差異有顯著性(P<0.05)；正常 HCCC-9810組和陰性對(duì)照組無(wú)明顯差異(P＞0.05)。Western blot結(jié)果顯示在PRL-3 SiRNA-2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中 MMP-7、MMP-9的表達(dá)明顯低于陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞、脂質(zhì)體對(duì)照細(xì)胞及空白對(duì)照HCCC-9810細(xì)胞,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而脂質(zhì)體對(duì)照組及陰性

17、對(duì)照組與空白對(duì)照組相比,MMP-7、MMP-9的表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　 [結(jié)論]:
　　 1.PRL-3在肝內(nèi)膽管癌中高表達(dá),且轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)陽(yáng)性率高于原發(fā)灶。PRL-3表達(dá)與肝內(nèi)膽管癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān),與預(yù)后負(fù)相關(guān),PRL-3有望成為肝內(nèi)膽管癌病人的預(yù)后標(biāo)志和潛在的治療靶點(diǎn)。
　　 2.PRL-3特異性siRNA能夠抑制肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞HCCC-9810中內(nèi)源性 PRL-3的表達(dá),并可以明顯抑制肝內(nèi)膽