轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的HSV-tk基因靶向?qū)敫伟┘?xì)胞的研究.pdf

1、【目的】構(gòu)建肝癌細(xì)胞靶向基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng),研究其介導(dǎo)的HSV-tk基因特異性轉(zhuǎn)移和對(duì)人肝癌細(xì)胞的體外殺傷作用.【方法】體外培養(yǎng)表達(dá)抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體人-鼠嵌合抗體的轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞D2C5.6,且用G418篩選;裸鼠(Balb/c,nu/nu)腹腔先用降植烷處理后腹腔注射轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞誘生腹水;正辛酸初提腹水,然后過DEAE-SephadexA-50柱,得到純化的抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的人-鼠嵌合抗體;以蛋白質(zhì)連接因子-水溶性碳二亞胺(EDC)介導(dǎo)抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體

2、抗體與多聚左旋賴氨酸連接(Ab-PLL),經(jīng)DEAE-Sephadex G-100柱層析得到Ab-PLL純品;大量提取攜帶HSV-tk基因的pEBAFP/tk質(zhì)粒;DNA阻滯試驗(yàn)判斷Ab-PLL、pEBAFP/tk間的最佳質(zhì)量比,按比例混勻,經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌,得到一種攜帶人AFP啟動(dòng)子調(diào)控的HSV-tk自殺基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng);分別轉(zhuǎn)染不同的細(xì)胞株進(jìn)行體外效應(yīng)研究:人肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC7721,人肺癌細(xì)胞株A549,用潮霉

3、素篩選陽性細(xì)胞,擴(kuò)大培養(yǎng),觀察給予不同濃度的前藥(GCV)對(duì)細(xì)胞的作用,同時(shí)測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞的上清惡性腫瘤特異性生長因子(TSGF),甲胎蛋白(AFP)濃度,用MTT法檢測(cè)前藥對(duì)不同細(xì)胞的殺傷作用.【結(jié)論】受體介導(dǎo)的肝癌特異性tk基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)構(gòu)建成功;該基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)只識(shí)別高表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)的細(xì)胞,具有明顯的靶向性,同時(shí)只在高分泌AFP的肝癌細(xì)胞中目的基因才被激活,具有組織特異性;該系統(tǒng)為高表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的肝癌細(xì)胞為靶細(xì)胞的基因治