去乙酰化酶Sirt3對(duì)腸上皮屏障功能的作用研究.pdf

1、背景及目的:
　　腸黏膜屏障是機(jī)體防御的重要屏障,多種急慢性病理?xiàng)l件誘發(fā)腸粘膜屏障功能(IBF)損傷的共同機(jī)制可能是腸粘膜缺氧,各種手術(shù)應(yīng)激、創(chuàng)傷等病理?xiàng)l件都會(huì)導(dǎo)致腸道的局部缺氧,進(jìn)而破壞緊密連接蛋白(TJs),影響該屏障的功能。而在這一過(guò)程中缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)起著重要作用。去乙?；窼irt3是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴型的組蛋白去乙?；讣易宓闹匾蓡T之一。其在能量代謝、基因沉默、DNA損傷修復(fù)、有絲

2、分裂調(diào)控及抗凋亡等方面起著重要的作用。而有關(guān)缺氧條件下去乙?；窼irt3能否調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子,減輕腸屏障功能受損的報(bào)道目前尚少。我們采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)及對(duì)腸上皮細(xì)胞的缺氧處理,觀察Sirt3對(duì)缺氧誘導(dǎo)因子-1α及腸屏障功能的影響。緊密連接是構(gòu)成腸道黏膜機(jī)械屏障上皮細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu),可防止腸道有害物質(zhì)侵入腸黏膜組織,維持腸上皮的通透性和細(xì)胞的極性。腸粘膜屏障功能調(diào)控與腸粘膜局部的缺氧密切相關(guān)。
　　目前研究已表明在諸如感

3、染性休克、內(nèi)毒血癥、缺血再灌注、炎癥性腸病等多種急慢性病理情況下,都會(huì)發(fā)生腸粘膜的局部缺氧,這種粘膜缺氧又會(huì)與炎癥反應(yīng)協(xié)同作用,而大量炎癥因子也會(huì)加劇缺氧造成的腸粘膜屏障功能損傷造成細(xì)菌和(或)內(nèi)毒素入血引發(fā)腸源性感染、全身性炎癥反應(yīng)、MODS等,而缺氧誘導(dǎo)因子是這一過(guò)程的重要調(diào)節(jié)因子,部分HIF-1α缺失可以減輕腸道缺血缺氧造成的損傷。
　　Sirtuins或沉默信息調(diào)節(jié)蛋白2(Silencing information reg

4、ulator2, S-ir2)類似酶是一個(gè)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴型的組蛋白去乙?；傅募易?Sirt3屬于該家族的成員之一。目前大量研究證明,Sirt3在慢性損傷過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,尤其是Sirt3可以抑制與腫瘤發(fā)生相關(guān)的瓦博格效應(yīng),從而減少腫瘤的突變概率。
　　HIF-1α作為與缺氧狀態(tài)密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,擔(dān)負(fù)著重要的腸粘膜屏障調(diào)節(jié)者的角色。為此,在本實(shí)驗(yàn)中我們采用RNA干擾技術(shù)首先驗(yàn)證Sirt3對(duì)HIF-1

5、α是否有調(diào)控作用。由于 Sirt3在腸道中相對(duì)較少,我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中對(duì)其在常氧狀態(tài)下蛋白和mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè),從而確保了實(shí)驗(yàn)的可行性。在研究中發(fā)現(xiàn)Sirt3在常氧與缺氧的不同時(shí)段表達(dá)并無(wú)明顯差異。在常氧+Sirt3-siRNA組蛋白幾乎沒(méi)有表達(dá),說(shuō)明干擾效果較好;在缺氧+Sirt3-siRNA組Sirt3蛋白仍有表達(dá),這可能與干擾效率相關(guān)。而HIF-1α在缺氧6h表達(dá)最明顯,這與我們前期的研究結(jié)論一致。同時(shí)HIF-1α蛋白表達(dá)升高時(shí)

6、,mRNA在常氧和低氧條件下變化不明顯,這與文獻(xiàn)報(bào)道的其在食管癌與膀胱癌中的變化相符。由于HIF-1α是一個(gè)具有中樞性意義的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,可以通過(guò)多個(gè)通路作用于緊密連接蛋白來(lái)執(zhí)行應(yīng)激和病理?xiàng)l件下的腸粘膜屏障調(diào)節(jié)機(jī)制,因此我們也對(duì)緊密連接蛋白及腸屏障功能的變化進(jìn)行了研究。
　　研究方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng):Caco-2細(xì)胞在37℃、5％co2、飽和濕度條件下用含20%胎牛血清MEM培養(yǎng)基培養(yǎng),用0.25%胰酶消化傳代。

7、　　2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染:細(xì)胞接種至六孔板后,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到30%-50%時(shí),各取5μl/孔Lipofectamine2000、Sirt3-siRNA用250μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀釋,室溫孵育5min;將兩者混合室溫靜置20min,然后加入含細(xì)胞的孔中,放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后將培養(yǎng)基換為含血清的完全培養(yǎng)基。3.細(xì)胞分組及處理:待細(xì)胞培養(yǎng)96h后,將細(xì)胞的培養(yǎng)基更換為1ml不含胎牛血清的MEM

8、培養(yǎng)液,分別行常氧處理(正常對(duì)照組Nx、常氧+Sirt3-siRNA組)、缺氧6h處理(1%O2 Hx組,缺氧6h+Sirt3-siRNA組)。將細(xì)胞置于37℃培養(yǎng)箱中,不間斷通入含有體積分?jǐn)?shù)為:1%O2,5%co2的混合氣體培養(yǎng)6h。
　　4.RNA的提取及RT-PCR:細(xì)胞缺氧6h后,使用冷鹽酸緩沖液(PBS)漂洗3次,每孔中加入Trizol,按照Trizol說(shuō)明書(shū)提取總RNA?？俁NA定量后取1μg按照PrimeScript

9、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,體系為20μl,合成 CDNA。RT-PCR擴(kuò)增條件:955min,9445s,58℃30s,72℃45s,共30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min。取8μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(110v,35min),采用Kodak Molecular Imaging軟件分析相對(duì)定量。
　　5.蛋白提取與Western blot檢測(cè):使用PBS將缺氧6h后的細(xì)胞漂洗3次,每孔中加入預(yù)冷混有10μl的苯甲基磺酰氟(

10、PMSF)的 RIPA裂解液100μl,冰上放置30min,12000xg4℃離心15min。使用蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定上清液蛋白含量。蛋白上樣后70V電泳,蛋白跑過(guò)上層膠后,改為100V電泳1.5h;200v恒流濕轉(zhuǎn)2h至PVDF膜,轉(zhuǎn)膜后使用50g/l的脫脂奶粉封閉2h,加入 Sirt3、Occludin、Claudin-1、Zo-1、HIF-1α、GAPDH一抗后4℃冰箱過(guò)夜。TBST洗膜3次,每次10min。將化學(xué)發(fā)光試劑均勻滴加在

11、目的蛋白上,使用圖像分析系統(tǒng)采集發(fā)光信號(hào)后,再通過(guò) Kodak Molecular Imaging軟件進(jìn)行密度分析,將其與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的灰度比值當(dāng)作目的蛋白的表達(dá)量。
　　6.腸上皮細(xì)胞跨上皮電阻(TER)測(cè)定:Caco-2細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于Transwell小室微孔膜上培養(yǎng),每日定時(shí)更換培養(yǎng)基,測(cè)定細(xì)胞 TER,當(dāng)測(cè)定的值達(dá)到穩(wěn)定后(4d),進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。處理分為4組(具體分組同上),每個(gè)處理組

12、取3個(gè)孔,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。TER值按照原始數(shù)值減去空白對(duì)照數(shù)值(Rcell monolayer=Rsample-Rblank)表示,結(jié)果表示為處理后的值占處理前的百分比。
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(`x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用t檢驗(yàn)。
　　研究結(jié)果:
　　1、Sirt3與HIF-1α蛋白表達(dá)變化。Western blot分析Sirt3和HIF

13、-1α不同處理組的變化:Nx+Sirt3-siRNA組Sirt3蛋白表達(dá)較Nx組下降52%; Hx+Sirt3-siRNA組Sirt3蛋白表達(dá)較Hx組下降35%。Nx+Sirt3-siRNA組HIF-1α蛋白表達(dá)升高(0.72±0.01),較Nx組上升約89.5%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01); Hx+Sirt3-siRNA組 HIF-1α蛋白表達(dá)升高(0.93±0.01),較Hx組升高約14.8%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)

14、。。
　　2、腸上皮細(xì)胞TJs的蛋白水平的變化:采用Western blot法,檢測(cè)2%O2 Hx組和缺氧6h+Sirt3-siRNA組蛋白的變化,分別與常氧組及常氧+Sirt3-siRNA組進(jìn)行比較, TJs選用 ZO-1、Occludin、Claudin-1,此3種分子在缺氧+Sirt3-siRNA組的蛋白水平(0.72±0.02、0.71±0.03、0.69±0.01)較Hx組下降22%、20%、12%差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<

15、0.01)而常氧+Sirt3-siRNA組TJs的蛋白水平與Nx組蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
　　3、腸上皮細(xì)胞 TJs的 mRNA水平的變化:采用 RT-PCR法,檢測(cè)2%O2 Hx組和缺氧6h+Sirt3-siRNA組mRNA的變化,分別與常氧組進(jìn)行比較。ZO-1、Occludin、Claudin-1的mRNA在缺氧+Sirt3-siRNA組的水平(0.88±0.03、0.80±0.01、0.84±0.01)較

16、 Hx組下降約22%、40%、28%差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。較Nx組下降42%、62%、32%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。而常氧+Sirt3-siRNA組TJs的mRNA水平與Nx組表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
　　4、腸上皮電阻的變化:Nx+Sirt3-siRNA組 TER值與 Nx組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05),而 Hx+Sirt3-siRNA組TER下降明顯(36.17±3.81)%較Hx組(

17、52.26±2.68)%下降30.8%,與常氧對(duì)照組(102.58±2.31)%比較下降64.7%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01),證明沉默 Sirt3,可使腸上皮TER降低,造成腸上皮通透性不穩(wěn)定。
　　結(jié)論:
　　1. SIRT3調(diào)節(jié)HIF1α穩(wěn)定。常氧與缺氧條件下Sirt3的表達(dá)變化無(wú)明顯差異,而在缺氧條件下HIF-1α表達(dá)比常氧條件下明顯升高,其中缺氧六小時(shí)表達(dá)最高。在缺氧條件下(6H)沉默Sirt3,發(fā)現(xiàn)HIF-