骨髓間充質干細胞構建組織工程軟骨修復兔關節(jié)軟骨缺損的實驗研究.pdf

1、創(chuàng)傷導致的關節(jié)軟骨的缺損及關節(jié)軟骨退行性病變長期以來一直都是國內外骨科界面臨的難題。近年來，將細胞生物學技術與材料工程技術相結合研究開發(fā)能修復、維持和改善病損組織功能的生物替代物即尋找合適的新型支架材料以及優(yōu)化種子細胞復合體外培養(yǎng)已是軟骨工程學的研究熱點[1,2]。 本研究采用組織工程學技術和干細胞技術相結合，通過體外誘導培養(yǎng)，將BMSCs進行擴增培養(yǎng)并將其復合到殼聚糖，目的一方面就是利用體外培養(yǎng)骨髓問充質干細胞與組織工程細胞外

2、支架整合技術構建組織工程軟骨：另一方面也擬探討殼聚糖該類支架是否為軟骨組織工程的合適的細胞載體。 本實驗設計分為兩部分 第一部分：兔骨髓間充質干細胞的體外傳代培養(yǎng)的實驗研究目的通過貼壁培養(yǎng)法和以密度梯度離心法獲取的成年兔骨髓間充質干細胞進行體外培養(yǎng)擴增，探討兔髓MSCs體外擴增、生長情況。 方法以骨髓穿刺于成年新西蘭兔股骨大粗隆處獲取骨髓約3ml，用貼壁分離法和密度梯度離心法分離兔骨髓MSCs，進行體外傳代培養(yǎng)。

3、用相差倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)及其變化；所獲得的細胞用免疫組化法檢測免疫表型CD71的表達；并繪制各自的生長曲線并相互比較，并取出部分爬片進行甲苯胺蘭染色。傳代培養(yǎng)后，用RT—PCR方法檢測2，3，4這三代MSCs誘導組和對照組的軟骨特異性ColⅡ的mRNA的表達。 結果體外培養(yǎng)能獲得高純度的兔骨髓MSCs，并且傳代能力強，擴增至20代后仍能獲得形態(tài)較為均一且主要為梭形的細胞。體外傳代后的數(shù)量培增，尤其在4-5代后表現(xiàn)更為明顯。初

4、期貼壁細胞主要呈紡錘形，并隨著傳代的次數(shù)增加而形態(tài)更為均一呈梭形。體外傳代培養(yǎng)至第5代，細胞數(shù)量較第一代增加了約20倍。所獲得的細胞具有CD71的免疫表型。細胞的生長曲線呈“S”形，具有一致的生長趨勢。 結論密度梯度離心法加差速貼壁培養(yǎng)法能提高MSCs的純度，減少污染，通過該途徑獲得的MSCs可作為軟骨組織工程種子細胞。 第二部分：骨髓間充質干細胞復合殼聚糖修復兔關節(jié)軟骨的組織工程實驗研究 目的觀察單純的殼聚糖與

5、未經(jīng)誘導的MSCs復合殼聚糖植入兔的骨關節(jié)軟骨缺損模型4周、8周后誘導異位成軟骨情況。 方法先將MSCS細胞與殼聚糖的復合培養(yǎng)，然后6只新西蘭大白兔建造全層關節(jié)軟骨缺損模型：i組為單純殼聚糖支架修復組，ii組為殼聚糖支架復合MSCS修復。分別于手術后4周、8周處死動物，通過大體形態(tài)、甲苯胺藍染色、過碘酸一雪夫反應(periodicacidShiftreaction，PAS)、II型膠原免疫組化觀察新生區(qū)軟骨組織修復情況。

6、 結果術后4周，i組(單純的殼聚糖修復組)僅有纖維組織增生；甲胺苯藍染色較淡；n組(MSCs復合殼聚糖修復組)關節(jié)軟骨缺損處有一定軟骨樣組織及膠原生成，雖然排列有些紊亂，但已于軟骨細胞形態(tài)有所相似；術后8周，n組關節(jié)軟骨缺損處有較明顯的軟骨組織增生，中央部分有較薄的軟骨組織生成，同時接近于正常的軟骨細胞形態(tài)；i組僅在結合正常軟骨部少量的軟骨樣組織生成；甲胺苯藍染色和免疫組化顯示ii組有表達；MSCs復合殼聚糖表達CollagenII明顯