PRRSV GP5蛋白與泛素融合蛋白基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建與免疫特性研究.pdf

1、　　豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是目前危害養(yǎng)豬業(yè)重要的病原之一。GP5蛋白是該病毒的主要保護(hù)性抗原，含有中和性抗原表位，但豬感染PRRSV后產(chǎn)生中和抗體的時(shí)間較晚，而且其滴度較低。泛素(簡(jiǎn)稱Ub)是一個(gè)由76個(gè)氨基酸殘基組成的非常保守的小蛋白質(zhì)。本研究將Ub基因插入GP5基因5端，旨在有效的將糖基化蛋白分解成小的多肽，促進(jìn)不同抗原表位提呈，增強(qiáng)免疫效果，為PRRSVDNA疫苗提供理論依據(jù)。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的PRRSVS

2、1毒株GP5基因序列設(shè)計(jì)合成了兩對(duì)分別含有BglⅡ、NotⅠ酶切位點(diǎn)的引物，以pcDNA3-ORF5質(zhì)粒為模板用PCR技術(shù)獲得大小為620bp左右的目的產(chǎn)物，經(jīng)純化后與真核表達(dá)載體pCMV-Ub同時(shí)進(jìn)行酶切，分別經(jīng)回收后連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，然后在氨芐青霉素抗性(AmpR)平板上挑取陽性菌落，過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)單酶切、雙酶切鑒定及DNA序列測(cè)定。用DNAStar軟件分析結(jié)果表明：擴(kuò)增片段與預(yù)期片段大小相符，且完全符合

3、載體閱讀框。該毒株GP5基因序列與美洲標(biāo)準(zhǔn)毒株和其它分離株的基因同源性為99﹪。最后分別命名為pCMV-Ub-GP5、pCMV-GP5?！　∮肞EG2000提取純化了重組質(zhì)粒pCMV-GP5和pCMV-Ub-GP5，將重組質(zhì)粒組以100μg背部皮內(nèi)注射免疫BALB/c小鼠，以間隔15天的頻率共免疫4次，用中和抗體試驗(yàn)和ELISA試驗(yàn)測(cè)定不同時(shí)間小鼠血清PRRSV抗體，以比較GP5基因和與泛素融合表達(dá)GP5基因的免疫特性。結(jié)果表明，第三

4、次免疫后14天(即首免后44天)pCMV-Ub-GP5和pCMV-GP5免疫組的小鼠血清ELISA試驗(yàn)OD490值均能達(dá)到1.0，且均可檢測(cè)到中和抗體的存在，在第4次免疫后14d(即首免后59d)中和抗體平均滴度為7和12，抗體產(chǎn)生時(shí)間和抗體滴度差異不顯著?！　∫陨涎芯拷Y(jié)果表明，本文成功構(gòu)建了PRRSVGP5蛋白和泛素融合蛋白基因重組質(zhì)粒pCMV-GP5和pCMV-Ub-GP5。重組質(zhì)粒DNA免疫小鼠都能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗PRRSV的特異性體