15243.解纖維素?zé)崴峋w維素酶在植物中的表達(dá)

1、碩士學(xué)位論文解纖維素?zé)崴嵋鹄w維素酶在植物中的表達(dá)ExpressionsofAcidothermuscellulolyticusCellulasesinPlants作者姓名：學(xué)科、專(zhuān)業(yè)：學(xué)號(hào)：指導(dǎo)教師：完成日期：奎塞型窒Q!墨生魚(yú)旦大連理工大學(xué)DalianUniversityofTechnology大連理工大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要大規(guī)模生產(chǎn)低成本的纖維素水解酶為木質(zhì)纖維素的生物轉(zhuǎn)化提供了經(jīng)濟(jì)可行性。利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器大量表達(dá)纖維素酶

2、，在生物質(zhì)能學(xué)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究利用解纖維素?zé)崴峋?Acidothermuscellulolyticus)的耐高溫內(nèi)切葡聚糖酶(E1)和外切葡聚糖酶(Guxl)，構(gòu)建了九種植物表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了將外源纖維素酶在煙草和水稻細(xì)胞中的表達(dá)。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將植物表達(dá)載體導(dǎo)入煙草或水稻中，通過(guò)PCR檢測(cè)和酶活性測(cè)定表明外源纖維素酶基因己成功轉(zhuǎn)化到煙草或水稻中，并獲得了具有酶活性的植株。在轉(zhuǎn)基因煙草中，定位在質(zhì)外體中的重組內(nèi)切葡聚糖酶E

3、1具有最高的酶比活性，約為游離在細(xì)胞質(zhì)中重組酶E1活性的3倍，而單獨(dú)表達(dá)外切葡聚糖酶催化結(jié)構(gòu)域的煙草酶比活性最低。轉(zhuǎn)基因水稻中同樣是定位于質(zhì)外體的重組酶E1具有最高的酶活性(143nmolMUmg。1TSPmin。1)，分別約為單獨(dú)表達(dá)內(nèi)切酶催化結(jié)構(gòu)域和外切酶催化結(jié)構(gòu)域酶活性的13和16倍。對(duì)于內(nèi)切葡聚糖酶的表達(dá)來(lái)說(shuō)，煙草致病抗性信號(hào)肽比煙草鈣網(wǎng)蛋白信號(hào)肽的效果更佳，同時(shí)也表明Ko圳(一CALSP序列對(duì)重組內(nèi)切葡聚糖素酶的比活性影響較小

4、。融合纖維素酶在酶活測(cè)定時(shí)沒(méi)有顯著的優(yōu)勢(shì)，分析認(rèn)為不同的植物細(xì)胞定位是酶活性差異的主要原因。對(duì)于水稻中表達(dá)的纖維素酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析顯示，重組內(nèi)切葡聚糖酶在70℃左右時(shí)具有較好的熱穩(wěn)定性，最適pH約為50，pH大于7時(shí)酶活性喪失嚴(yán)重。含有重組內(nèi)切葡聚糖酶的水稻葉片在室溫條件下貯存一個(gè)月后，酶活性損失約25％。培養(yǎng)過(guò)程中，與野生型植株相比，轉(zhuǎn)基因煙草和水稻植株均沒(méi)有顯著的表型變化，可見(jiàn)在植物中表達(dá)的外源耐高溫纖維素酶沒(méi)有對(duì)植物造成較為嚴(yán)重