口蹄疫病毒基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)大豆的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、利用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服疫苗已成為目前研究的熱點(diǎn).與傳統(tǒng)疫苗相比,植物源性疫苗具有安全、穩(wěn)定、高效和廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn).植物作為生產(chǎn)疫苗的載體可將抗原表達(dá)于植物的可食部位(例如種子和塊莖).當(dāng)植物被食用或飼喂時(shí),植物源性疫苗可激發(fā)保護(hù)性的黏膜免疫反應(yīng).隨著生物技術(shù)的不斷完善,植物生物反應(yīng)器將會(huì)成為疫苗生產(chǎn)的有效途徑,并部分替代傳統(tǒng)疫苗的生產(chǎn)方式.口蹄疫(Foot and Mouth Disease)是一種高發(fā)性流行傳染病,常在國(guó)際間大規(guī)模爆發(fā)

2、,目前尚無(wú)治愈本病的藥物,現(xiàn)在使用較廣泛的是酵母源性疫苗.因?yàn)榻湍冈葱砸呙缟a(chǎn)成本較高,貯運(yùn)過(guò)程中需要低溫,注射接種需要特定設(shè)備而限制了它的應(yīng)用.利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)植物源性的口蹄疫疫苗前景廣闊.目前,口蹄疫病毒基因(FMDV)已經(jīng)導(dǎo)入馬鈴薯、煙草和苜蓿等植物,有關(guān)口蹄疫病毒基因?qū)氪蠖怪械难芯课匆?jiàn)報(bào)道.根據(jù)口蹄疫病毒基因序列FP1(包括FVP1,實(shí)驗(yàn)操作與FP1相同)設(shè)計(jì)引物,同時(shí)引入酶切位點(diǎn)BamHI和SaLI.通過(guò)PCR反應(yīng)從pGE

3、M-FP1載體上擴(kuò)增FP1基因,并插入pUCM-T載體構(gòu)建成pUCM-FP1中間載體.PCR和酶切鑒定正確的克隆進(jìn)行測(cè)序,序列分析結(jié)果表明,插入目標(biāo)序列完全正確.用BamHI和SaLI同時(shí)酶切pUCM-FP1中間載體和植物組成型表達(dá)載體pBin438,構(gòu)建成植物表達(dá)載體pBin-FP1.熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109.經(jīng)過(guò)PCR和酶切鑒定正確的克隆轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101,成功構(gòu)建了2個(gè)載體,分別命名為pBin-FP1、pBin-FVP

4、1.用攜帶此表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌GV3101侵染大豆.通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)再生體系轉(zhuǎn)化大豆.采用從發(fā)芽5-7d的大豆無(wú)菌苗切取子葉節(jié)外植體,經(jīng)農(nóng)桿菌浸染和3d的共培養(yǎng)后,轉(zhuǎn)移到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,10d后從子葉節(jié)處誘導(dǎo)出叢生芽.在含50μg/ml卡那霉素的伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周后,抗性芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),共得到51株卡那抗性植株.28株移栽成活的T<,0>代植株已正常開(kāi)花和結(jié)莢,經(jīng)PCR檢測(cè)獲得目的基因的陽(yáng)性植株15株.初步驗(yàn)證了