柔嫩艾美爾球蟲耐藥株的蛋白質(zhì)研究.pdf

1、用中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海家畜寄生蟲病研究所球蟲組誘導(dǎo)并保存的兩個柔嫩艾美爾球蟲耐藥株(馬度拉霉素耐藥株和地克珠利耐藥株)及其同母源敏感株感染2周齡無球蟲羅曼小公雞,用PBS液分別收取三個蟲株第二代裂殖子、未孢子化卵囊、孢子化卵囊,純化后-70℃保存.1、加PBS反復(fù)凍融5次(-70℃10min,35℃水浴5min),冰浴條件下150W間斷超聲30min,12000r/min離心1h,蛋白質(zhì)含量測定后進(jìn)行SDS-PAGE,凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色

2、,利用Imagemaster VDS軟件系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行分析.結(jié)果顯示,地克珠利耐藥株孢子化卵囊有三條超表達(dá)的蛋白質(zhì)條帶,其分子量和相對含量分別為:42.0ku、2.1%,26.5ku、45.8%,25.5ku、23.8%;馬杜拉霉素耐藥株孢子化卵囊有一條超表達(dá)蛋白質(zhì)條帶,其分子量為26.5ku,相對含量為23.0%;耐藥株其余各階段的蛋白質(zhì)相對含量和蛋白質(zhì)條帶與敏感株沒有明顯差異;2、敏感株與耐藥株第二代裂殖子蛋白質(zhì)采用銀染后經(jīng)Imag

3、emaster VDS軟件分析未發(fā)現(xiàn)有條帶差異;3、以40mmolTris(pH9.5),冰浴,150W間斷超聲破碎提取第二代裂殖子蛋白質(zhì),Brondford法定量,蛋白質(zhì)上樣量80μg,pH3-10L 13cmIPG干膠條(Amersham Parmacia Biotech)用IPGphor等電聚焦儀進(jìn)行等電聚焦,設(shè)定總聚焦65560vh,平衡后轉(zhuǎn)移至DALTsix電泳系統(tǒng)以0.5mm12.5%均勻膠進(jìn)行垂直電泳SDS-PAGE,凝膠

4、銀染,用Amersham Parmacia Biotech的2D-Elie軟件進(jìn)行分析.結(jié)果顯示:與敏感株相比各耐藥株均有四個表達(dá)差異點,其分子量和等電點為地克珠利耐藥株(Mr/pI):32.7ku/6.3、31ku/7.35、29.2ku/6.85、27.3ku/5.7,馬杜霉素耐藥株(Mr/pI):33.5ku/5.9、29.2ku/6.85、26.7ku/5.6、26.7ku/5.6.這些差異斑點蛋白質(zhì)均為一些小分子蛋白質(zhì),可能參