抗除草劑bar基因表達載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、該實驗從抗除草劑轉(zhuǎn)基因Bobwhite小麥中,利用PCR克隆的方法擴增出bar基因全長,并在原核表達系統(tǒng)中表達,鑒定表達蛋白的活性,將能夠正確編碼PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶的bar基因片段,經(jīng)過適當?shù)男揎棙?gòu)建入真核表達載體.并將此構(gòu)建的真核表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌獲得工程菌,為基因轉(zhuǎn)化及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化做了前提工作.并對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥體系作了初步的研究,為選育出適宜在安徽麥區(qū)種植的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗除草劑小麥新品種做了基礎(chǔ)工作.該實驗研究結(jié)果表明:1.利用PCR

2、方法對已知序列基因的克隆是簡單有效的方法,但很多因素影響PCR的特異性,其中退火溫度起著關(guān)鍵性作用.該實驗采用了高保真pfu DNA聚合酶,在退火溫度61℃條件下從轉(zhuǎn)基因Bobwhite品種基因組DNA中擴增出特異性片段,將此片段插入克隆載體pGEM-7fz(+),經(jīng)測序和序列分析表明,所擴增得到的片段含有bar基因完整的讀碼框,并且序列與GenBank中發(fā)表的序列完全一致.2.選用pET32a表達載體和BL21trxB(DE3)宿主菌

3、的原核表達系統(tǒng),對擴增得到的片段進行表達鑒定.經(jīng)IPTG誘導表達的融合蛋白的分子量39.6kDa,目的片段表達蛋白分子量20.1kDa,與預(yù)計的分子量20.0kDa相符.并且表達的蛋白酶(PAT)經(jīng)DTNB比色法鑒定,具有酶活性.3.為了目的基因在真核生物中有效的翻譯和表達,通過PCR方法對bar基因起始密碼子ATG旁側(cè)序列進行改造.改造后的目的基因克隆于真核表達載體pBI121,構(gòu)建表達載體pBI121-bar,通過三親雜交法將真核表

4、達載體pBI121-bar轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404,成功構(gòu)建出工程菌.4.小麥離體培養(yǎng)中,基因型、培養(yǎng)基激素濃度與外植體類型是影響小麥胚性愈傷組織誘導和再生頻率的3個主要因素.基因型的影響主要影響到胚性愈傷組織的發(fā)生頻率,以幼胚為外植體楊麥87158可以達到81.35﹪,而安農(nóng)92484只能達到16.81﹪.在所試的品種中對于成熟胚在2,4-D質(zhì)量濃度為4.0mg/L時出愈率和胚性愈傷組織誘導率達到最大值,而對于幼胚不同品種表現(xiàn)有所差異

5、,其中楊麥87158和安農(nóng)98005在2,4-D濃度為2.0mg/L時胚性愈傷組織誘導率最高,而安農(nóng)92484則是在4.0mg/L時效果較好.同時研究表明不同外植體不僅影響到出愈率,更主要影響胚性愈傷組織的形成.5.在轉(zhuǎn)化后抗性愈傷組織篩選中,適應(yīng)的PPT篩選濃度為3.0mg/L,Cef有效抑菌濃度為200μg/ml,乙酰丁香酮有效誘導濃度為100μmol/L,0.5﹪表面活性劑Tween20,可以使GUS染色均勻,但并不是T-DNA轉(zhuǎn)