鼓槌石斛的離體快繁及SPS基因的克隆與表達分析.pdf

1、鼓槌石斛(Dendrobiun chrysotoxum Lindl)，為蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生附生草本植物，又名金弓石斛。其花金黃色，氣味芳香，花期較長，具有良好的觀賞價值。同時，其莖內含有多糖、毛蘭素、毛蘭菲及鼓槌菲等有效成分，具有較高的藥用價值。鼓槌石斛是兼具觀賞與藥用于一身的珍貴石斛種類之一，開發(fā)應用前景廣闊。
　　隨著對鼓槌石斛保健價值認識的提高和市場需求量的日趨增長，其野生資源

2、遭到嚴重破壞，種苗數量嚴重不足。為了保護現有的野生資源，滿足日益增長的市場需求，對鼓槌石斛進行組培快繁技術研究迫在眉睫。另外，石斛的主要藥用成分之一多糖，因為其具有調節(jié)免疫、降低血糖及抗腫瘤等功能，引起了眾多專家學者的廣泛關注。但目前對石斛多糖的研究主要集中于對其多糖含量測定、結構分析、多糖相關酶活性測定等生理生化方面，而有關克隆鼓槌石斛多糖代謝中的相關基因以及該基因的表達研究等分子生物學方面還未見報道。因此有必要采用現代生物技術手段進

3、行鼓槌石斛的研究。本試驗以鼓槌石斛為材料，進行離體快繁、蔗糖磷酸合成酶SPS基因克隆及其qRT-PCR分析研究，為鼓槌石斛苗木生產提供技術支持;并為研究石斛多糖合成機理、代謝路徑及培養(yǎng)優(yōu)質石斛新品種奠定基礎。研究結果如下:
　　1鼓槌石斛的離體快繁研究
　　首先，以鼓槌石斛種子為外植體，建立了無菌體系。將種子接入無菌萌發(fā)培養(yǎng)基1/4MS+0.5 mg·L-1KT+1.0g·L-1蛋白胨+150 g·L-1椰乳+15 g·L-

4、1糖+1.0g·L-1AC中，(PH=6.0)。30 d后可見種子全部萌發(fā)，萌發(fā)率100％。85 d后形成綠色無菌小苗，生長狀況較好，成功獲得無菌增殖材料。
　　其次，將初代培養(yǎng)85 d的無菌幼苗進行增殖培養(yǎng)，通過正交試驗比較培養(yǎng)基種類、NAA和6-BA濃度、香蕉泥濃度對無菌苗增殖的影響，篩選出適宜的增殖培養(yǎng)基。試驗結果表明，4種因素對鼓槌石斛增殖效果的影響大小為:香蕉泥＞6-BA＞NAA＞基礎培養(yǎng)基;最佳增殖培養(yǎng)基為:MS+0.

5、5 mg/L NAA+2.0 mg/L BA+50 g/L香蕉泥，增殖系數高達4.7，且幼苗長勢良好。之后以正交試驗結果的最佳培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，對增殖條件進行了優(yōu)化處理。無菌苗增殖的優(yōu)化條件:糖濃度為30 g/L，有機添加物為香蕉泥，接種苗株高在2.5 cm左右，叢植芽數量為5株/叢時有利于提高增殖系數和促進小苗的生長。
　　最后，以株高大于3 cm的試管苗為材料進行生根研究，結果表明:選用NAA0.3 mg·L-1壯苗生根效果

6、最好，在木屑基質中成活率100％。
　　2不同方法對鼓槌石斛根、莖、葉RNA的提取
　　本研究根據石斛中富含多糖、多酚類等次生代謝產物的特點，選擇Triozl試劑盒法、RNA prep Pure Plant Kit試劑盒法和CTAB法3種提取方法進行了比較。結果表明:CTAB法提取的總RNA條帶較清晰，OD260/OD280在2.0左右，RNA的濃度在200～600μg/μL之間，RNA純度較高，能夠滿足下一步試驗需要。因此

7、，CTAB法是較理想的提取鼓槌石斛根、莖、葉RNA的方法。
　　3鼓槌石斛SPS基因片段的克隆
　　本研究成功克隆了鼓槌石斛SPS基因。經過測序結果分析，其序列長度為2411bp，編碼803個氨基酸，與蘭科植物鐵皮石斛的SPS基因氨基酸序列的一致性最高，為97％，與其他科植物SPS基因的氨基酸序列的一致性均高于72％。系統(tǒng)進化分析也表明該基因與單子葉植物在進化上親緣關系較近。生物信息學分析表明，鼓槌石斛SPS基因編碼的蛋白屬

8、于親水性蛋白，有2個功能結構域，分別是蔗糖合成功能域及糖基轉移功能域。本試驗首次克隆并報道了鼓槌石斛SPS基因。將該基因命名為Dendrobium chrysotoxum SPS，并在GenBank注冊，登錄號為:KP696500。
　　4鼓槌石斛EF-1α基因的克隆
　　本研究首次克隆了鼓槌石斛3個EF-1α基因片段，其序列長度均為620bp，均編碼206個氨基酸，將這些片段進行Blast比較，結果顯示:3條序列與其他植物

9、的EF-1α基因核苷酸序列的同源性均在87％-89％之間，而氨基酸序列的同源性都在99％以上，通過對EF-1α基因序列的聚類分析發(fā)現，鼓槌石斛的3個EF-1α基因無論與單子葉植物還是雙子葉植物的EF-1α親緣關系都非常近，與單子葉植物油棕、蝴蝶蘭的一致性達100％，再次證明高等植物的EF-1α基因是一種高度保守的看家基因，為研究其他基因的表達奠定了基礎。
　　5鼓槌石斛SPS基因的時空表達分析
　　本試驗以成功克隆出的鼓槌石

10、斛EF-1α基因作為內參基因，通過RT-qPCR方法，對鼓槌石斛中不同生長年限的葉片、莖部及根中SPS基因的相對表達量進行了分析。結果表明，SPS基因在鼓槌石斛的根、莖、葉中均有表達，而在不同組織之間的相對表達量因不同生長年限而有所差異。從總體來看，SPS基因在鼓槌石斛組織中的表達呈現莖＞葉＞根的趨勢，且不管是植株的葉還是莖，SPS在第二年的生長時期的相對表達量達到最高峰，之后隨著時間的推移有所下降，表明該基因可能在葉片蔗糖合成代謝過程