肽聚糖對siRNA抑制凡納濱對蝦WSSV的強化及其轉(zhuǎn)錄組研究.pdf

1、近年來，WSSV感染致病率有所下降，但是WSSV感染在一定條件下仍然是對蝦養(yǎng)殖的主要威脅，因此研究對蝦抗WSSV治療及其機理具有重要意義。肽聚糖對對蝦的免疫效果較低，同樣siRNA干擾也不能有效抵抗WSSV感染和發(fā)病，其免疫保護也較低。試驗設(shè)計在強化免疫條件下，WSSV感染后發(fā)病狀況變化，再利用siRNA干擾技術(shù)，觀察對蝦WSSV感染后，其保護率的變化，期望探討對蝦抗病毒免疫機理和抗WSSV的治療技術(shù)，并為在親本的有效實用的病毒防治上提

2、供技術(shù)與理論基礎(chǔ)。
　　本實驗的主要內(nèi)容有以下三個方面。(1)利用超聲波溶解從溶藻弧菌細胞壁中提取出的肽聚糖，注射到凡納濱對蝦肌肉內(nèi)，再感染W(wǎng)SSV。在不同時間點記錄凡納濱對蝦死亡數(shù)，試劑盒法測定對蝦免疫學(xué)指標。(2)確定vp28-siRNA干擾WSSV最佳濃度，在凡納濱對蝦感染W(wǎng)SSV第24h時，把最佳濃度的vp28-siRNA注射到凡納濱對蝦，利用半定量PCR和熒光定量檢測在不同時間點確定siRNA干擾效果。(3)凡納濱對蝦在

3、注射肽聚糖后，感染W(wǎng)SSV，不同時間點注射vp28-siRNA，檢測對蝦免疫保護率。
　　基于上面的實驗設(shè)計，采集五個不同實驗組對蝦的肝胰腺進行轉(zhuǎn)錄組測序和分析。具體研究結(jié)果與分析如下:
　　1.實驗驗證WSSV病毒毒性，接著凡納對蝦分別注射0.05mg/mL（PSA組）、0.1mg/mL（PSB組）和0.15mg/mL（PSC組）的肽聚糖，進行免疫刺激24h后感染W(wǎng)SSV，測定其免疫保護率和肝胰腺、血清中的免疫學(xué)指標。實驗

4、結(jié)果表明:超低溫保存的WSSV粗提液在對蝦體內(nèi)復(fù)活后重新提取的粗提液，經(jīng)PCR檢測顯示W(wǎng)SSV呈陽性;注射到凡納濱對蝦體內(nèi)，第1天后出現(xiàn)大量死亡數(shù);對死亡對蝦PCR檢測，結(jié)果顯示W(wǎng)SSV呈陽性，證明WSSV具有較強的感染性。與對照組相比，PSA組的保護率為36.67％，PSB組為46.67％，PSC組為56.67％;對蝦的保護率隨著肽聚糖的濃度增大而增大。凡納濱對蝦血清中的PO酶活的情況如下: PSA組在72h時達到最大值，PSB組在4

5、8h時達到最大值，PSC組也在24h時達到最大值。同時，實驗組對蝦肝胰腺中的ACP、AKP、SOD和NOS酶活與對照組相比，有極顯著性的差異(P＜0.01)。PSA組ACP在24h時達到最大值，AKP在第12h時達到最大值，SOD在48h時達到最大，NOS在24h時達到最大值;PSB組ACP、AKP和SOD都在48h時達到最大值，NOS在12h時達到最大值，但在96h時又有一個高峰;PSC組ACP和AKP在24h時達到最大值，SOD在1

6、2h時達到最大值，之后逐漸減少，在72h時又達到一個高峰，NOS在第6h時達到最大值，之后逐漸減少。
　　2.確定了siRNA最佳濃度為0.1μg/μL，每尾注射100μL時，干擾效果是最好，同時得到其保護率為40％。熒光定量檢測凡納濱對蝦體內(nèi)病毒拷貝數(shù)，結(jié)果表明在第48h時能很好干擾WSSV病毒復(fù)制，干擾效果呈現(xiàn)持續(xù)到第120h。
　　3.0.1mg/mL肽聚糖對凡納濱對蝦進行免疫24h，感染W(wǎng)SSV之后不同時間點注射vp

7、28-siRNA的實驗結(jié)果顯示:6h注射組的保護率為80％，12h注射組為63.33％，24h注射組為56.67％。保護率比單注射siRNA或肽聚糖的保護率高。
　　4.采集五個組的肝胰腺進行了轉(zhuǎn)錄組測序和分析。通過Illumina Hiseq2000平臺測序，總計產(chǎn)出24，001，958，340nt數(shù)據(jù)。組裝結(jié)果總Unigene35，274個，總長38，807，225nt，平均長度1，100nt，N50達到2，012nt。差異表