湖北省不同地區(qū)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的抗藥性調(diào)查.pdf

1、雞球蟲(chóng)病(Coccidiosis)是由艾美耳屬的原蟲(chóng)寄生于雞腸道細(xì)胞，從而引起的以腸炎、腹瀉帶血、飼料轉(zhuǎn)化率下降甚至死亡為主要特征的寄生蟲(chóng)病。雞球蟲(chóng)病在世界各地都有分布和流行，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，阻礙了養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展(Williams2002;Dalluouland Lillehoj2005)。迄今為止，使用化學(xué)藥物治療是生產(chǎn)中防治雞球蟲(chóng)病的主要手段，但隨著抗球蟲(chóng)藥越來(lái)越頻繁的使用，球蟲(chóng)對(duì)藥物的抗藥性問(wèn)題也隨之浮現(xiàn)。由于球蟲(chóng)疫苗的研制存

2、在很多關(guān)鍵問(wèn)題尚未解決（Sharmanetal2010），因此在未來(lái)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間里，使用抗球蟲(chóng)藥仍是防治球蟲(chóng)病的主要手段（Chapmanand Shirley2002）?？顾幮允请u球蟲(chóng)病防治中最為嚴(yán)重的問(wèn)題，也是亟待解決的難題。
　　在本研究中，從湖北省8個(gè)地區(qū)的23個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)采集新鮮糞便，通過(guò)雞體擴(kuò)大增殖實(shí)驗(yàn)分離得到20個(gè)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)野外分離株;利用PCR和RT-PCR分別擴(kuò)增不同蟲(chóng)株的球蟲(chóng)抗藥性可能相關(guān)基因MIC2，SAG，c

3、ation-transportingATPase和Cytb，測(cè)序分析了不同蟲(chóng)株之間基因的序列差異;通過(guò)籠養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)了不同基因型和地理分布的蟲(chóng)株對(duì)馬杜拉霉素、地克珠利和癸氧喹啉的敏感程度，分析相關(guān)抗藥基因的突變與抗藥性產(chǎn)生的關(guān)系。
　　(1)不同地區(qū)E.tenella分離株的獲得
　　采集了湖北省黃岡、黃石、荊州、隨州、天門(mén)、武漢、襄陽(yáng)、咸寧8個(gè)地區(qū)23個(gè)雞場(chǎng)的新鮮糞便，球蟲(chóng)卵囊鏡檢結(jié)果顯示有20個(gè)樣本檢出球蟲(chóng)卵囊，感染率為

4、87.0％。檢出的卵囊孢子化后在雞體內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)大增殖，根據(jù)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)寄生位置的特異性，收集盲腸中的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)卵囊。雞體增殖實(shí)驗(yàn)得到20個(gè)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)野外分離株。
　　(2)相關(guān)抗藥基因的擴(kuò)增及測(cè)序
　　通過(guò)PCR和RT-PCR，擴(kuò)增得到MIC2，SAG,cation-transporting ATPase和Cytb基因，序列測(cè)定結(jié)果表明:MIC2基因無(wú)堿基突變;SAG基因蟲(chóng)株之間無(wú)突變，但與Genebank報(bào)道的序列

5、存在一個(gè)堿基差異，此突變?yōu)橥x突變;根據(jù)堆型艾美耳球蟲(chóng)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATPase基因保守序列設(shè)計(jì)相關(guān)PCR引物，在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)中擴(kuò)增得到約500bp產(chǎn)物，測(cè)序并進(jìn)行同源性比對(duì)。同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)此段序列與其他艾美耳球蟲(chóng)有很高的相似性，表明擴(kuò)增得到的此段序列為柔嫩艾美耳球蟲(chóng)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATPase基因的一部分，序列比對(duì)表明此段序列在不同分離蟲(chóng)株間無(wú)突變;Cytb基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)第22位點(diǎn)，第49位點(diǎn)和第838位點(diǎn)存在差異，且均為錯(cuò)義突變，分別導(dǎo)致Cy

6、tb氨基酸序列第8位點(diǎn)(Qisite)、第17位點(diǎn)和第280位點(diǎn)的氨基酸變異。
　　(3)不同E.tenella分離株對(duì)三種抗球蟲(chóng)藥的敏感程度
　　根據(jù)基因型和地理分布，把20個(gè)蟲(chóng)株分為9類，通過(guò)籠養(yǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)馬杜拉霉素、地克珠利和癸氧喹啉的敏感程度。結(jié)果表明野外分離蟲(chóng)株對(duì)馬杜拉霉素都表現(xiàn)嚴(yán)重的抗藥性，蟲(chóng)株間無(wú)明顯差異;野外分離蟲(chóng)株對(duì)地克珠利敏感，蟲(chóng)株間差異不大;癸氧喹啉的抗藥性則表現(xiàn)明顯的蟲(chóng)株地區(qū)差異與基因型的差異:湖北東

7、部蟲(chóng)株敏感，其他地方蟲(chóng)株抗藥;未突變株敏感，突變株則表現(xiàn)明顯的抗藥性。
　　(4)相關(guān)抗藥性基因的突變與抗藥性產(chǎn)生的關(guān)系
　　通過(guò)分析MIC2、SAG、cation-transporting ATPase和Cytb基因的序列與相關(guān)抗藥性的關(guān)系，得出結(jié)論:本研究中無(wú)法證實(shí)球蟲(chóng)對(duì)地克珠利抗藥性產(chǎn)生機(jī)制與MIC2&SAG的基因突變有關(guān);球蟲(chóng)對(duì)馬杜拉霉素的抗藥性與ATPase基因的突變無(wú)關(guān);Cytb第22位堿基的突變可能是導(dǎo)致球蟲(chóng)癸