棉花GhWRKY40基因的分離及其功能研究.pdf

1、植物在其生長發(fā)育的整個生命周期中，會遭遇干旱、澇害、低溫、高溫、病原菌侵襲、機械損傷等各種不利的環(huán)境條件。這些脅迫通過一系列的信號分子被感知和傳導，并最終啟動不同類型的蛋白如轉(zhuǎn)錄因子、酶、分子伴侶和離子通道等的合成或改變它們的活性來影響脅迫誘導的基因的調(diào)節(jié)。在上述蛋白中，轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)節(jié)特定靶基因的表達在激活脅迫響應中發(fā)揮著重要的作用，它們對植物的正常生長發(fā)育和生理及環(huán)境的刺激的響應也是必須的。WRKY蛋白是一類含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，

2、在所有的高等植物中都由一大類基因家族編碼。目前許多研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在許多生理過程中發(fā)揮著重要的作用。雖然對WRKY轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)有大量的研究，但是多集中在擬南芥等模式生物中，而且不同植物的同源基因或者相同植物的同一家族的不同基因其生物學功能都會有一定的差異。此外，目前關(guān)于WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究主要揭示了WRKY轉(zhuǎn)錄因子的各種功能，而對WRKY轉(zhuǎn)錄因子的作用機制和其是否參與多種脅迫的互作并不清楚。棉花作為世界范圍內(nèi)的經(jīng)濟作物之一，

3、同時也是重要的纖維和油料來源，了解棉花中WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能具有重要的理論意義和應用價值。本研究以魯棉22為實驗材料，克隆得到了WRKY基因家族的一個成員，命名為GhWRKY40，并對其表達模式和功能進行了分析:
　　(1)進化樹分析表明，同源克隆所獲得基因是WRKYⅡa亞族基因。亞細胞定位分析表明該基因定位在細胞核內(nèi)，因此推測其可能在細胞核中發(fā)揮相應的生物學功能。轉(zhuǎn)錄活性分析表明該基因具有轉(zhuǎn)錄激活活性。
　　(2)利用q

4、PCR分析GhWRKY40在棉花中的表達模式表明，GhWRKY40的轉(zhuǎn)錄水平受傷等非生物脅迫和生物脅迫青枯雷爾氏細菌及多種信號分子水楊酸(SA)、乙烯(ET)、茉莉酸(JA)和過氧化氫(H2O2)等的誘導，說明該基因可能參與多種信號通路。為了進一步證明上述實驗結(jié)果，采用反向PCR的方法克隆得到GhWRKY40的部分啟動子序列，經(jīng)過PlantCARE和PLACE軟件，預測得到一系列與環(huán)境脅迫應答和生長發(fā)育相關(guān)的順式作用元件。由此得出，Gh

5、WRKY40可能參與與這些元件相關(guān)的功能的應答。
　　(3)構(gòu)建GhWRKY40的過表達載體，利用農(nóng)桿菌介導的葉盤法獲得轉(zhuǎn)基因本生煙植株。GhWRKY40過表達植株較野生型植株表現(xiàn)出對傷脅迫的抗性，而GhWRKY40過表達植株對生物脅迫青枯細菌的侵染卻表現(xiàn)出敏感性。qPCR結(jié)果表明，在傷和青枯細菌處理后，轉(zhuǎn)基因植株中的JA響應相關(guān)基因JAZ1、JAZ3與SA響應相關(guān)基因PR1a、PR2和PR4的表達量較野生型植株均有所降低。由此表