棉花(Gossypium hirsutum)纖維中木聚糖合成相關(guān)基因的分子鑒定.pdf

1、棉花是世界上重要的纖維作物和油料作物，棉纖維是研究植物細胞壁發(fā)生和細胞伸長的理想模型之一。成熟棉纖維含有超過90％的纖維素、少量的半纖維素、果膠和蛋白質(zhì)。關(guān)于細胞壁組分（特別是半纖維素）在棉纖維發(fā)育中的作用尚未見報道，半纖維素的改變?nèi)绾斡绊懨蘩w維發(fā)育，如何影響纖維素—半纖維素網(wǎng)絡而影響纖維品質(zhì)尚知之甚少。本文根據(jù)擬南芥和楊樹中已經(jīng)報道的參與半纖維素木聚糖合成的蛋白，基于生物信息學方法從棉花公共EST資料室中分離鑒定了20個可能參與棉細胞

2、纖維半纖維素合成的候選基因，對這些基因編碼蛋白的特征進行了詳細分析，并分別選擇了一個參與主鏈合成和還原末端的候選基因進行了功能驗證，主要結(jié)果如下:
　　1.棉花木聚糖合成相關(guān)基因的篩查鑒定及功能預測
　　通過生物信息學的方法，基于目前擬南芥和楊樹中木聚糖合成基因的研究，結(jié)合棉花D基因組序列信息，從棉花EST文庫中篩查鑒定了20個可能參與棉花次生細胞壁半纖維素合成的基因，并獲得全長cDNA序列。
　　通過蛋白質(zhì)序列對比分

3、析，跨膜結(jié)構(gòu)域分析，信號肽分析，蛋白定位分析，3D結(jié)構(gòu)分析，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析和進化樹等方法分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所分離鑒定的候選基因所編碼的蛋白質(zhì)分屬不同的參與木聚糖生物合成的酶家族，其中，有2個GT47家族的基因，8個GT8家族的基因，5個ESK類基因，4個GXMT類基因和1個RWA類基因，預測這些基因可能是定位于高爾基體上的Ⅱ型膜蛋白，并且具有與木聚糖合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，說明這些候選基因可能參與木聚糖的合成。
　　2.木聚糖合成相關(guān)基因

4、在棉花組織中的表達分析
　　提取棉花不同組織和不同發(fā)育階段棉花纖維的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用半定量RT-PCR和熒光定量RT-PCR方法對這些基因進行表達分析，結(jié)果顯示這些基因均在棉花纖維中表達，其中一些基因在棉花纖維次生壁加厚期優(yōu)勢表達，如GhR WA在棉花纖維次生壁發(fā)育時期(20DPA)特異性表達，GhGT47A和GhGT47B在15DPA和20DPA纖維中有較高的表達量，說明這些基因極有可能參與棉花纖維次生壁合成。

5、r>　　3.GhGT47B基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的功能分析
　　為了證明我們分離的候選基因確實參與到木聚糖合成，我們分別選擇了一個參與木聚糖主鏈合成的候選基因GhGT47B，一個參與木聚糖還原末端合成的候選基因GhGT47A進行功能驗證，這兩個基因均在棉纖維發(fā)育的次生壁合成時期高量表達。GhGT47B的同源蛋白IRX10在擬南芥中參與木聚糖主鏈合成，其突變體莖具有典型的不規(guī)則木質(zhì)部(irregular xylem，IRX)和木糖含量

6、減少的表型。構(gòu)建了GhGT47B的回補載體轉(zhuǎn)化irx10突變體，對回補轉(zhuǎn)化苗的8周莖和根的切片分析顯示，與irx10突變體相比，回補植株莖中木質(zhì)部不規(guī)則的程度減輕，但不能完全恢復到野生型水平，說明GhGT47B與擬南芥IRX10有著類似的功能，但可能有功能歧化。
　　4.GhGT47A/B轉(zhuǎn)基因棉花鑒定分析
　　為研究這GhGT47A/B在棉花纖維發(fā)育中的作用，構(gòu)建GhGT47A/B過量表達載體和GhGT47A/B RNAi