多倍體魚IKKε基因功能的初步研究.pdf

1、天然免疫又被稱之為非特異性免疫，指?jìng)€(gè)體與生具有的、作用范圍廣、不針對(duì)特定抗原的免疫能力。天然免疫是一種包含大量模式識(shí)別受體（PRR)的高度復(fù)雜的快速誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，這些模式識(shí)別受體識(shí)別各種病原體相關(guān)分子模式(Pathogen Associated Molecular Patterns，PAMPs)，并通過各個(gè)不同的信號(hào)通路激活機(jī)體的免疫應(yīng)答。
　　IKKε(inhibitor of NF-κB kinaseε)是天然免疫系統(tǒng)中Tol

2、l-Like信號(hào)通路以及NF-κB(nuclear factor-kappa B)信號(hào)通路中的一種激酶，它是最新發(fā)現(xiàn)的IκB激酶家族(IκB kinase，IKKs)的成員，最初被認(rèn)定為脂多糖誘導(dǎo)的絲氨酸/蘇氨酸激酶。IKKε在信號(hào)分子的作用下磷酸化IκBα來誘導(dǎo)激活NF-κB，或者與TBK1(TANK-binding kinase 1)在支架蛋白的作用下磷酸化IRF3(interferon regulatory factor 3)與I

3、RF7(interferon regulatory factor 7)激酶，從而誘導(dǎo)IFN的分泌。
　　天然免疫是魚類等低等脊椎動(dòng)物的防御病害侵襲的基礎(chǔ)，存在于哺乳動(dòng)物中的天然免疫信號(hào)通路的許多基因組分在硬骨魚中也是保守的。目前，魚類TLR、RIG-I，以及MAVS基因都已經(jīng)成為當(dāng)今魚類天然免疫的研究熱點(diǎn)，然而有關(guān)魚類IKKε在天然免疫中的功能研究卻罕見報(bào)道。
　　在本論文中，我們克隆了鯉科重要經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類——草魚、青魚的I

4、KKε基因cDNA全長(zhǎng)序列，以及二倍體/三倍體/四倍體特殊性魚類的IKKε基因部分cDNA基因序列，并初步研究了青魚IKKε基因的功能。本論文的研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.青魚IKKε基因cDNA全長(zhǎng)2537bp，其中5'非編碼區(qū)長(zhǎng)度為285bp，開放閱讀框的長(zhǎng)度為2169bp，3'非編碼區(qū)的長(zhǎng)度為83bp，預(yù)測(cè)可編碼723個(gè)氨基酸，蛋白分子量為82556。草魚IKKε基因的cDNA全長(zhǎng)2529，其中5'非編碼區(qū)長(zhǎng)度為274bp

5、，開放閱讀框的長(zhǎng)度為2169bp，3'非編碼區(qū)的長(zhǎng)度為86bp，預(yù)測(cè)可編碼723個(gè)氨基酸，蛋白分子量為82476.9。
　　2.比較青魚與草魚的IKKε基因的同源性得知:青魚草魚的IKKε基因同源性非常高，達(dá)到了97.3％;與斑馬魚IKKε基因的序列同源性為73.4％;與哺乳動(dòng)物和鳥類的IKKε基因同源性較低。通過進(jìn)化樹分析也可以發(fā)現(xiàn)，青魚與草魚的IKKε基因出現(xiàn)在同一個(gè)分支，符合它們同源性很高的比對(duì)結(jié)果。對(duì)青魚與草魚的IKKε的

6、氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，兩者的蛋白質(zhì)序列都具有IκB激酶家族相似的蛋白結(jié)構(gòu)域。
　　3.以pcDNA5-FRT/TO載體和CDH-CMV-Linker載體為基礎(chǔ)構(gòu)建了表達(dá)青魚的IKKε基因的重組質(zhì)粒，pcDNA5-FRT/TO-FLAG-BC·ikk與pcDNA5-FRT/TO-BC·ikk-FLAG以及CDH-CMV-Puro-FLAG-BC·ikk與CDH-CMV-Puro-BC·ikk-FLAG載體。通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將該重組質(zhì)粒

7、轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，Westen blot檢測(cè)到青魚的IKKε基因能夠在HEK293T細(xì)胞中正常表達(dá)，并證實(shí)了其蛋白分子量大約為85KD左右。
　　4.使用Lipofectamine2000將FRT/TO-Flag-bcIKKε及FRT/TO-bcIKKε-Flag重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3以及鯉科魚類成纖維細(xì)胞EPC細(xì)胞中，通過免疫熒光和激光共聚焦掃描分析結(jié)果表明青魚IKKε基因主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。