斜紋夜蛾硫氧還蛋白及過氧化物還原酶基因的分子克隆、表達與功能分析.pdf

1、斜紋夜蛾(Spodoptera litura)屬鱗翅目，夜蛾科，是一種世界性分布的多食性害蟲，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。深入開展斜紋夜蛾生理生化機制研究，并在此基礎(chǔ)上尋找有效防治方法已成為當(dāng)務(wù)之急。硫氧還蛋白(Thioredoxin，Trx)和過氧化物還原酶(Peroxiredoxin，Prx)屬于硫氧還蛋白抗氧化系統(tǒng)，在清除生物體內(nèi)活性氧族(ROS)過程中發(fā)揮重要作用。本論文研究了斜紋夜蛾SlTrx1、SlTrx2和SlPrx5

2、在抗氧化過程中的功能，為斜紋夜蛾的防治提供新思路和方法。主要結(jié)果如下:
　　從斜紋夜蛾cDNA文庫中篩選并克隆了兩個硫氧還蛋白基因，分別為SlTrx1和SlTrx2。SlTrx1基因的開放閱讀框為318bp，擬編碼106個氨基酸;SlTrx2基因的開放閱讀框為447bp，擬編碼149個氨基酸，SlTrx2基因含有一個內(nèi)含子，長度為116bp。二者同時含有一個典型的多聚腺苷酸信號序列(AATAAA)和一個polyA尾巴。氨基酸序列同

3、源性分析結(jié)果顯示，斜紋夜蛾SlTrx1與棉鈴蟲HaTrx的相似性高達98％;SlTrx2與家蠶BmTrx2的相似性高達87％。系統(tǒng)發(fā)育分析表明SlTrx1屬于1家族，SlTrx2屬于2家族。使用SWISS-MODEL軟件對SlTrx1和SlTrx2的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行模擬，獲得了蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)圖，并標(biāo)注了活性位點的位置。采用桿狀病毒表達系統(tǒng)獲得了可溶性重組蛋白SlTrx1和SlTrx2，經(jīng)SDS-PAGE分析，重組SlTrx1的分子量約為

4、14kDa;重組SlTrx2的分子量約為16kDa。重組蛋白具有還原胰島素二硫鍵的活性，且重組SlTrx1和SlTrx2的最佳反應(yīng)溫度均為35℃，最佳pH值均為7.0。qRT-PCR研究結(jié)果表明，SlTrx1和SlTrx2基因在整個發(fā)育時期表達水平十分相似，在6齡幼蟲中表現(xiàn)為表皮的表達量最高，中腸次之，脂肪體最低;蛹期在各組織中的表達量均維持在較低水平;成蟲期表皮的表達量均迅速上升。另外，另外H2O2、過氧化氫異丙苯、茚蟲威和氰氟蟲腙均

5、可上調(diào)SlTrx1和SlTrx2基因的轉(zhuǎn)錄水平。
　　從斜紋夜蛾cDNA文庫中篩選并克隆出一個過氧化物還原酶5（SlPrx5），SlPrx5基因的開放閱讀框為477bp，擬編碼159個氨基酸，含有一個典型的多聚腺苷酸信號序列(AATAAA)和一個polyA尾巴。氨基酸序列同源性分析結(jié)果顯示，斜紋夜蛾SlPrx5與柑橘鳳蝶PxPrx5的相似性高達91％。通過系統(tǒng)發(fā)育分析，獲得了系統(tǒng)發(fā)育圖譜。使用SWISS-MODEL軟件對SlPrx

6、5的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行模擬，獲得了蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)圖，并標(biāo)注了活性位點位置。采用桿狀病毒表達系統(tǒng)獲得了分子量為20kDa可溶性重組蛋白SlPrx5。重組SlPrx5具有分解H2O2和DNA的保護活性。構(gòu)建了表達重組SlPrx5的E.ColiBL21菌株，并將含有不同濃度H2O2、過氧化氫異丙苯和CdCl2的濾紙?zhí)幚碓摼旰蛯φ站辍＝Y(jié)果表明，表達重組SlPrx5的E.ColiBL21菌株抑菌圈直徑均顯著小于對照菌株。qRT-PCR研究結(jié)果表