斜帶石斑魚(yú)腺苷酸環(huán)化酶刺激多肽Ⅰ型受體cDNA的克隆和序列分析及表達(dá).pdf

1、該文采用RT-PCR方法和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE),從斜帶石斑魚(yú)(Epinephelus coioides)下丘腦總RNA中進(jìn)行擴(kuò)增,得到3種形式的PAC1-R cDNA全長(zhǎng)序列,分別是PAC1-R、PAC1-R3u和PAC1-Rct.PAC1-R是與其它物種PAC1-R同源性很高的形式,cDNA全長(zhǎng)為2320bp,編碼447個(gè)氨基酸;PAC1-R3u是只有3'非編碼區(qū)與PAC1-R不同,而5'非編碼區(qū)、編碼區(qū)都與PAC1-

2、R相同的形式,迄今只在大鼠中發(fā)現(xiàn)了5'非編碼區(qū)發(fā)生變化的PACAP Ⅰ型受體,至于PACAP Ⅰ型受體的選擇性剪接發(fā)生在3'非編碼區(qū)的形式,還未見(jiàn)有報(bào)道,其cDNA全長(zhǎng)為2257bp,編碼447個(gè)氨基酸;PAC1-Rct,在核苷酸序列上與斜帶石斑魚(yú)PAC1-R有很大不同;在氨基酸層面上,C末端發(fā)生很大的變化,其cDNA全長(zhǎng)為1853bp,由402個(gè)氨基酸組成.在斜帶石斑魚(yú)中發(fā)現(xiàn)的幾種新的形式擴(kuò)大了PACAP Ⅰ型受體家族,使之成為G蛋白

3、偶聯(lián)受體家族中變化最多的受體之一.將斜帶石斑魚(yú)三種PACAP Ⅰ型受體的氨基酸序列與其它脊椎動(dòng)物進(jìn)行同源性比較,并構(gòu)建出進(jìn)化樹(shù),結(jié)果顯示:斜帶石斑魚(yú)PAC1-R、PAC1-R3u與金魚(yú)PAC1-R的親緣性最近,而與斜帶石斑魚(yú)PAC1-Rct的親緣性次之,表明PAC1-Rct是一種變化較大的形式;在進(jìn)化距離上,斜帶石斑魚(yú)三種PACAPⅠ型受體與兩棲類(lèi)的蛙親緣性較高,與哺乳類(lèi)的人和鼠類(lèi)的親緣性較低.利用生物信息學(xué)軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)成分分

4、析,尋找該蛋白的保守區(qū)、等電點(diǎn)、分子量、不穩(wěn)定指數(shù)和消光系數(shù)等生物學(xué)特征,并預(yù)測(cè)蛋白序列的motif、低復(fù)雜度區(qū)域、卷曲螺旋、跨膜螺旋、疏水性、信號(hào)肽及抗原決定簇等結(jié)構(gòu)功能域,以指導(dǎo)對(duì)斜帶石斑魚(yú)的PACAP Ⅰ型受體基因功能的進(jìn)一步研究.采用半定量RT-PCR方法對(duì)斜帶石斑魚(yú)PAC1-R基因的3種不同形式在腦部各區(qū)、不同組織、以及胚胎發(fā)育和幼體發(fā)育過(guò)程中表達(dá)的情況進(jìn)行了初步的研究,并通過(guò)Southern blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了RT-PCR結(jié)

5、果的可信性.結(jié)果表明,3種形式在各腦區(qū)的表達(dá)水平都顯著高于組織,正體現(xiàn)了PACAP作為神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子起作用;在胚胎發(fā)育過(guò)程中,三種PACAP Ⅰ型受體都是在神經(jīng)胚期開(kāi)始放量表達(dá),其表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他時(shí)期,尤其是PAC1-R,證明PACAP作為一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起重要作用;在幼體發(fā)育過(guò)程中,PAC1-R和PAC1-Rct的mRNA水平調(diào)節(jié)的變化情況基本與仔魚(yú)的行為和消化系統(tǒng)的研究相吻合,而PAC1-R3u

6、幾乎沒(méi)有表達(dá).這些數(shù)據(jù)表明:這3種形式在不同組織以及發(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)出選擇性表達(dá),即它們的表達(dá)不是細(xì)胞特異性的,而是大部分組織或不同時(shí)期擁有不同比例的每種受體形式.將編碼斜帶石斑魚(yú)PAC1-R基因克隆于表達(dá)載體pET-15b構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒gPAC1-R-pET-15b.大腸桿菌BL21在轉(zhuǎn)化后gPAC1-R-pET-15b經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)了微量的gPAC1-R融合蛋白.我們對(duì)表達(dá)條件如溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化,但收效甚微.

7、用小鼠抗His-Tag抗體進(jìn)行Westernblotting檢測(cè),結(jié)果顯示為陰性,這主要是由于表達(dá)的融合PAC1-R蛋白量極低或無(wú)表達(dá).鑒于PACAP及其受體的研究與魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)的密切關(guān)系及斜帶石斑魚(yú)在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的重要性,該實(shí)驗(yàn)對(duì)斜帶石斑魚(yú)PACAPⅠ型受體的cDNA進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析以及mRNA的表達(dá)調(diào)節(jié)和原核表達(dá)開(kāi)展研究,期望對(duì)魚(yú)類(lèi)PACAP Ⅰ型受體的表達(dá)特征和分子生物學(xué)有進(jìn)一步的了解,為使PACAP應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖,促進(jìn)魚(yú)類(lèi)生