兩株狂犬病病毒糖蛋白的桿狀病毒表達(dá)及其免疫原性研究.pdf

1、狂犬病是指由狂犬病病毒(rabies virus,RV)感染動(dòng)物機(jī)體而引起的一種以腦脊髓炎為主要病理特征,以神經(jīng)癥狀為主要臨床表現(xiàn)的人獸共患傳染病。古埃及時(shí)代該傳染病就已經(jīng)開(kāi)始流行,直到2012年,全球范圍內(nèi)仍有90多個(gè)國(guó)家或地區(qū)發(fā)生狂犬病。近十年來(lái),全球每年約有50,000至60,000人死于該病。在我國(guó),每年患狂犬病死亡人數(shù)多達(dá)2000~3000人。雖然近些年來(lái)偶有關(guān)于人狂犬病治愈的報(bào)道,但現(xiàn)在仍然沒(méi)有有效的治療規(guī)程和相關(guān)藥物,所以

2、一旦狂犬病病毒感染后出現(xiàn)神經(jīng)癥狀,死亡率仍幾乎為100％。因此,目前防控狂犬病的策略仍然是以預(yù)防為主,接種疫苗是其中最為有效的方法。這不僅是因?yàn)槿吮┞犊袢『蠹皶r(shí)接種狂犬疫苗能使自身產(chǎn)生抗體,從而有效預(yù)防狂犬病的發(fā)生,更重要的是如果在狂犬病的中間宿主群體中進(jìn)行了高覆蓋率(70%)的免疫接種,則可切斷狂犬病病毒在中間宿主群體間的傳播,從而為徹底消滅狂犬病提供可能。
　　現(xiàn)在,市面上的人或動(dòng)物狂犬疫苗大都為滅活疫苗。但滅活苗成本較高,

3、對(duì)于經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)國(guó)家來(lái)說(shuō)不是有效控制、消滅狂犬病的理想選擇。亞單位疫苗屬于基因工程疫苗的一種,價(jià)格一般相對(duì)低廉,且不像重組活載體疫苗那樣涉及活載體病毒等生物安全因素,相對(duì)安全,易得到相關(guān)部門(mén)審批,現(xiàn)已有多種亞單位疫苗得到臨床應(yīng)用。因此,亞單位疫苗有望作為新型狂犬疫苗的重點(diǎn)發(fā)展方向之一。
　　本研究以探索狂犬病亞單位疫苗研制為目的,開(kāi)展了如下試驗(yàn):
　　1.狂犬病病毒糖蛋白基因重組桿狀病毒的構(gòu)建。試驗(yàn)內(nèi)容:
　　①狂犬病病

4、毒街毒株BD06及疫苗株SRV9糖蛋白基因的RT-PCR擴(kuò)增獲取。
　?、趯煞N糖蛋白基因分別克隆入Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)所提供的供體質(zhì)粒(pFastBacI)中,酶切鑒定正確后,轉(zhuǎn)化DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞,待重組供體質(zhì)粒與其中穿梭質(zhì)粒(含有桿狀病毒全基因組的質(zhì)粒,Bacmid)發(fā)生定向轉(zhuǎn)座后,挑取白色單菌落,提取重組穿梭質(zhì)粒后,以M13通用引物對(duì)重組穿梭質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定,之后選取構(gòu)建正確克隆。
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5、以鑒定正確的重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞,拯救重組桿狀病毒,并通過(guò)電鏡觀察等方法對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。
　　④以免疫熒光、SDS-PAGE及western blot等方法鑒定重組桿狀病毒是否成功表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白。
　　2.重組桿狀病毒表達(dá)的狂犬病病毒糖蛋白的免疫原性試驗(yàn)。試驗(yàn)內(nèi)容:
　　①兩種粗制狂犬病病毒糖蛋白以高、低兩個(gè)梯度的劑量分別免疫小鼠。
　?、诿庖吆?4d及28d分別對(duì)免疫小鼠進(jìn)行尾靜脈采血并分離血清

6、,以熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(FAVN)方法測(cè)定血清中狂犬病病毒中和抗體水平。
　　③免疫后35d,以100LD50狂犬標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒(CVS-24)對(duì)所有免疫組小鼠進(jìn)行腦內(nèi)攻毒試驗(yàn)。
　　④攻毒后每日觀察,記錄小鼠死亡狀況,統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果,分析兩種糖蛋白免疫效果,評(píng)價(jià)其免疫原性并比較兩種糖蛋白的免疫原性是否具有差異。
　　通過(guò)上述試驗(yàn),獲得以下試驗(yàn)結(jié)果:
　　1.成功擴(kuò)增出SRV9株與BD06株狂犬病病毒糖蛋白基因,將其

7、克隆至供體質(zhì)粒后,經(jīng)酶切鑒定,獲得正確構(gòu)建的重組供體質(zhì)粒。PCR鑒定結(jié)果顯示成功獲得分別含有SRV9株與BD06株狂犬病病毒糖蛋白基因的重組穿梭質(zhì)粒。電鏡觀察轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)細(xì)胞病變的細(xì)胞培養(yǎng)物,可觀察到具有明顯桿狀病毒形態(tài)的病毒顆粒。對(duì)接種第三代重組桿狀病毒病變的Sf9細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE及wesern blot鑒定,結(jié)果顯示在接近72kDa大小處出現(xiàn)蛋白條帶,野生型桿狀病毒感染細(xì)胞在相應(yīng)位置未出現(xiàn)類似蛋白條帶。對(duì)接種第三代重組桿狀病毒

8、的Sf9細(xì)胞以狂犬病病毒糖蛋白熒光單抗進(jìn)行熒光抗體染色,熒光顯微鏡下可觀察到特異性綠色熒光,野生型桿狀病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞經(jīng)同樣處理后熒光顯微鏡下沒(méi)有觀察到特異性綠色熒光。
　　2.重組桿狀病毒表達(dá)的狂犬病病毒糖蛋白小鼠免疫結(jié)果顯示,SRV9株糖蛋白與BD06株糖蛋白在高劑量水平時(shí),均可誘導(dǎo)100%的小鼠發(fā)生血清陽(yáng)轉(zhuǎn),整體抗體水平分別能達(dá)到13.5IU/ml和3.42IU/ml,并能提供100%的針對(duì)致死劑量狂犬病病毒的攻毒保護(hù);但在

9、低劑量水平時(shí),SRV9株糖蛋白僅能夠誘導(dǎo)部分小鼠發(fā)生陽(yáng)轉(zhuǎn),整體抗體水平接近于0,且不能為小鼠提供任何保護(hù),而B(niǎo)D06株糖蛋白依然可以誘導(dǎo)100%小鼠發(fā)生陽(yáng)轉(zhuǎn)(整體抗體水平依然可以達(dá)到5.92IU/ml)并能為其提供80%的保護(hù)率。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,在兩種狂犬病病毒糖蛋白在誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗體水平及發(fā)生陽(yáng)轉(zhuǎn)率方面差異均極為顯著(p<0.01)。
　　通過(guò)以上結(jié)果,得出以下結(jié)論:
　　1.獲得兩株能夠分別表達(dá)狂犬病病毒SRV9株與BD0

10、6株糖蛋白的重組桿狀病毒。重組桿狀病毒所表達(dá)出的兩種糖蛋白均具有免疫原性,能夠作為狂犬病亞單位疫苗研制的候選抗原。
　　2.BD06株糖蛋白的免疫原性要顯著高于SRV9株糖蛋白,這表明前者更適合用于亞單位疫苗的研制。
　　3.不同毒株糖蛋白免疫原性存在顯著性差異表明進(jìn)一步篩選免疫原性更高的糖蛋白具有重要意義,且篩選范圍不必局限于狂犬病病毒疫苗株。
　　論文創(chuàng)新點(diǎn):
　　1.通過(guò)研究桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)出的狂犬病