擬穴青蟹細(xì)胞膜脂筏結(jié)構(gòu)相關(guān)基因SpFLT-1的克隆、表達(dá)特性及其與病原入胞機(jī)制的相關(guān)性研究.pdf

1、擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)是我國最重要的海水養(yǎng)殖蟹類之一，具有重要的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值。集約化的養(yǎng)殖模式導(dǎo)致了近年來擬穴青蟹的疾病不斷爆發(fā)，其中以弧菌等革蘭氏陰性菌為主的細(xì)菌性病原是導(dǎo)致青蟹發(fā)病的重要誘因之一。然而由于對病原微生物感染擬穴青蟹的致病機(jī)理知之甚少，目前對其尚無有效的免疫防治措施。因此，闡明病原微生物的致病途徑對于控制擬穴青蟹疾病爆發(fā)具有重要的意義。
　　 病原微生物在長期的進(jìn)化過程中發(fā)展出一整

2、套逃避、干擾、抑制和對抗宿主免疫系統(tǒng)的機(jī)制，其中利用宿主的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和受體蛋白進(jìn)入胞內(nèi)是病原微生物感染宿主的重要途徑之一。為了研究病原在入侵?jǐn)M穴青蟹過程中與宿主作用的關(guān)鍵蛋白，進(jìn)而為有效阻斷病原微生物入侵途徑提供理論依據(jù)，本論文比較系統(tǒng)地研究了細(xì)胞膜脂筏結(jié)構(gòu)相關(guān)基因SpFLT-1的結(jié)構(gòu)特點、組織器官分布特性以及溶藻弧菌誘導(dǎo)后的體內(nèi)表達(dá)模式，并通過體外培養(yǎng)原代青蟹血淋巴細(xì)胞，初步探討了SpFLT-1在弧菌內(nèi)吞過程中可能發(fā)揮的功能，該項研究

3、為初步闡明病原微生物感染擬穴青蟹的致病機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。取得的結(jié)果如下:
　　 1成功構(gòu)建了LPS刺激擬穴青蟹血淋巴細(xì)胞SSHcDNA文庫。本試驗以雌性擬穴青蟹為對象，利用抑制差減雜交技術(shù)(Suppressionsubtractivehybridization，SSH)構(gòu)建了脂多糖(Lipopolysacchadde，LPS)刺激下血淋巴細(xì)胞cDNA文庫，文庫總?cè)萘繛?.2×105cfu。隨機(jī)選取了721個克隆子進(jìn)行測序，共獲

4、得271個上調(diào)表達(dá)基因。利用AmiGO基因釋義工具，將所有271個基因按照參與的生物學(xué)過程進(jìn)行分類，其中179個基因分別參與6個不同的生物學(xué)過程，92個基因?qū)儆谕耆粗δ艿幕颉Ｖ档靡惶岬氖?，上?71個基因中只有18個基因(6.6％)在甲殼類動物中報道過，其余253個基因均是首次在擬穴青蟹中發(fā)現(xiàn)。從該文庫中篩選獲得細(xì)胞膜脂筏結(jié)構(gòu)相關(guān)基因flotillin-1(SpFLT-1)。
　　 2克隆獲得擬穴青蟹膜脂筏結(jié)構(gòu)基因flot

5、illins家族成員SpFLT-1的全基因序列和另一成員SpFLT-2的全長eDNA序列。SpFLT-1的全長cDNA序列包括1278bp的開放閱讀框(Openreadingframe，ORF)、42bp的5'非翻譯區(qū)(Untranslatedregion，UTR)和103bp的3'UTR三部分(GenBank登錄號:FJ774690)。預(yù)測該基因編碼426個氨基酸，編碼的蛋白分子量為47kDa。SpFLT-1基因包含9個外顯子和8個內(nèi)

6、含子，其DNA側(cè)翼片段長度為1310bp(GenBank登錄號:JX228176)。SpFLT-2的全長cDNA序列包括1317bp的ORF、339bp的5'UTR和171bp的3'UTR三部分(GenBank登錄號:KC865733)，預(yù)測其編碼439個氨基酸，編碼的蛋白分子量為48kDa。
　　 3以純化的擬穴青蟹SpFLT-1原核表達(dá)產(chǎn)物制備了特異性強且效價高的多克隆抗體。根據(jù)SpFLT-1基因的全長cDNA序列，構(gòu)建了p

7、ET-28a(+)/SpFLT-1融合表達(dá)載體，并成功在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)出重組蛋白。純化的蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定為目的蛋白。利用純化好的目的蛋白制備了特異性強、效價高的多克隆抗體，可以用于后續(xù)蛋白功能的相關(guān)研究。
　　 4分析了擬穴青蟹SpFLT-1和SpFLT-2基因的組織表達(dá)分布特性以及在青蟹不同發(fā)育階段的表達(dá)模式。結(jié)果表明SpFLT-1基因在各組織器官中表現(xiàn)出組成型表達(dá)特點，血淋巴細(xì)胞中表達(dá)量最高;SpFLT-2基因在各組織器官

8、中表達(dá)水平較一致。SpFLT-1mRNA在青蟹胚胎發(fā)育早期表達(dá)量較高，伴隨著生長發(fā)育進(jìn)程其表達(dá)量逐步降低;SpFLT-2基因在溞狀幼體Ⅰ期表達(dá)量最高。SpFLT-1和SpFLT-2兩個基因的轉(zhuǎn)錄水平在卵巢發(fā)育早期表達(dá)量最高，隨著擬穴青蟹逐漸性成熟過程，兩個基因轉(zhuǎn)錄水平有降低的趨勢。
　　 5研究了SpFLT-1蛋白在擬穴青蟹部分組織器官中的表達(dá)及分布特征。選取了SpFLT-1mRNA表達(dá)水平較高的5個組織器官:卵巢、鰓、胸神經(jīng)團(tuán)

9、、心臟、中腸，利用Western-blot技術(shù)研究了SpFLT-1蛋白表達(dá)模式。SpFLT-1蛋白在中腸中表達(dá)量最高。免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)試驗結(jié)果顯示SpFLT-1蛋白廣泛分布于青蟹卵泡上皮細(xì)胞、鰓絲上皮細(xì)胞層、胸神經(jīng)團(tuán)神經(jīng)細(xì)胞、心肌外膜以及中腸的上皮細(xì)胞層中。
　　 6分析了溶藻弧菌感染擬穴青蟹后SpFLT-1基因在血淋巴細(xì)胞和鰓中轉(zhuǎn)錄和翻譯水平變化。結(jié)果顯示，青蟹感染溶藻弧菌3h后

10、，SpFLT-1mRNA在血淋巴細(xì)胞和鰓中顯著上調(diào)表達(dá)。梯度密度離心和Western-blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)SpFLT-1蛋白不僅分布于青蟹血淋巴細(xì)胞和鰓上皮細(xì)胞的膜脂筏結(jié)構(gòu)中，還可能在胞內(nèi)表達(dá)并發(fā)揮特定的功能;SpFLT-1蛋白與弧菌蛋白之間可能相互作用，二者作用時間短暫。結(jié)果提示SpFLT-1在青蟹血淋巴細(xì)胞和鰓細(xì)胞中可能是溶藻弧菌入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白。
　　 7初步探討了SpFLT-1基因在擬穴青蟹血淋巴細(xì)胞內(nèi)吞溶藻弧菌過程中