黑線倉鼠KiSS-1-GPR54系統(tǒng)在季節(jié)性繁殖與光周期調(diào)控中的作用.pdf

1、黑線倉鼠(Cricetulus barabensis)是一種典型的季節(jié)性繁殖動物,也是華北地區(qū)農(nóng)業(yè)害鼠的優(yōu)勢種,高繁殖力是影響其種群數(shù)量波動的主要原因之一,因此研究黑線倉鼠的季節(jié)性繁殖調(diào)控機制顯得尤為重要。本文從繁殖調(diào)控相關(guān)基因KiSS-1和GPR54入手,從分子水平上揭示害鼠種群數(shù)量季節(jié)性波動機制,對鼠害的綜合防控提供新的思路。KiSS-1是與動物繁殖行為密切相關(guān)的基因,其編碼產(chǎn)物Kisspeptins通過與GPR54結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)功能

2、,KiSS-1/GPR54系統(tǒng)不僅介導了光周期對繁殖的調(diào)節(jié),還影響著動物的青春期啟動、發(fā)情周期維持以及探究、攻擊、擇偶等多種行為。本研究通過RT-PCR的方法克隆黑線倉鼠的KiSS-1和GPR54 cDNA序列,并使用生物信息學的分析方法預測蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及功能,結(jié)合多個物種的相應序列進行分子系統(tǒng)進化研究,采用實時熒光定量的方法分別檢測兩者在不同發(fā)育階段、不同發(fā)情周期和不同組織器官中的表達情況,預測KiSS-1/GPR54在黑線倉鼠生

3、長、發(fā)育以及繁殖過程中所起的作用,從分子生物學角度尋找控制黑線倉鼠數(shù)量及其危害的有效方法。
　　本研究克隆拼接獲得完整的KiSS-1和部分GPR54的cDNA序列。其中,KiSS-1 cDNA序列558bp,包含完整的CDS區(qū)和3￠端,GenBank登錄號:JQ219667;GPR54 cDNA序列578bp,全為編碼區(qū)序列,GenBank登錄號:JQ685855。采用生物信息學方法對兩基因的核苷酸序列和相應的氨基酸序列進行分析,

4、并預測其蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果表明:KiSS-15￠端編碼的MTALASWQLLLLLCVTIFG19個氨基酸是Kisspeptins的信號肽序列,NWNSFGLRY氨基酸殘基構(gòu)成成熟的Kisspeptin-10分子,67位的-R和121-122位的-RR是可能的水解位點,其蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中含有較多的α螺旋,對Kisspeptins功能的發(fā)揮有重要意義,同時應用CPHmodel程序預測得到了KiSS-1的三級結(jié)構(gòu)。擴增得到的GP

5、R54編碼區(qū)序列涵蓋了完整的7個跨膜α螺旋中的前四個螺旋,包括兩個胞內(nèi)環(huán)和兩個胞外環(huán),在第4外顯子處存在一處可能的可變剪接位點,并用SWISS-MODEL程序預測得到了該蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。使用Clustal2.0分別將黑線倉鼠KiSS-1和GPR54 cDNA序列與金倉鼠(Mesocricetus auratus)、大鼠、小鼠、人等多個物種的相應cDNA序列進行同源性對比分析,并使用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,聚類分析表明,黑線倉鼠與金

6、倉鼠親緣關(guān)系最近,與大鼠、小鼠較近,與偶蹄目和靈長目的幾個物種親緣關(guān)系均較遠。
　　隨后,本研究分別比較了KiSS-1和GPR54在雌雄黑線倉鼠亞成年期、成年發(fā)情期以及老年期三個發(fā)育時期下丘腦和生殖器官(♀:卵巢、子宮;♂:睪丸、附睪)中的相對表達量。結(jié)果發(fā)現(xiàn):KiSS-1和GPR54在下丘腦和生殖器官中均有表達,但兩基因的表達模式在不同發(fā)育時期和不同器官中表現(xiàn)并不同。KiSS-1和GPR54在雌性亞成體中表達明顯高于其他各發(fā)育時

7、期,發(fā)揮了顯著的作用,這與 KiSS-1/GPR54系統(tǒng)能激發(fā)幼體青春期發(fā)育的研究結(jié)果相一致。KiSS-1和GPR54發(fā)揮生理作用的部位隨發(fā)育時期的不同會發(fā)生遷移,幼年時期主要在中樞器官發(fā)揮功能,成年期之后逐漸向外周器官(以旁分泌方式發(fā)揮作用)轉(zhuǎn)移。這與已有的關(guān)于KiSS-1青春期發(fā)育啟動的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控機制相一致。不同發(fā)情周期中,中樞和外周器官的KiSS-1和GPR54表達量也并不相同。成年雌鼠下丘腦KiSS-1的表達呈現(xiàn)脈沖式周期波

8、動,發(fā)情間期表達較少,在發(fā)情前期達到高峰,發(fā)情期、發(fā)情后期表達略有減少,GPR54僅在發(fā)情前期和發(fā)情期表達顯著增高,因此推測發(fā)情周期的維持方面,KiSS-1和GPR54可能存在不同的調(diào)節(jié)模式,兩者的結(jié)合調(diào)控可能表現(xiàn)出與KiSS-1表達相一致的“劑量依賴”關(guān)系,且卵巢等處KiSS-1表達峰滯后于下丘腦的KiSS-1表達峰,推測這可能是與調(diào)控的精確性和時序性相適應的結(jié)果。
　　實驗通過模擬自然光照的變化,研究了不同光周期影響下雌雄黑線

9、倉鼠在生理、生態(tài)、分子遺傳學的變化。結(jié)果說明,長光周期及漸長光周期對黑線倉鼠的繁殖有促進作用,短光周期和漸短光周期對黑線倉鼠體重、靜止代謝、自發(fā)行為、攻擊行為等方面的抑制作用較為顯著。激素檢測結(jié)果顯示,雌性黑線倉鼠褪黑激素的含量與下丘腦 KiSS-1的mRNA表達量呈顯著負相關(guān),血清和糞便樣品中的雌激素含量與卵巢KiSS-1的mRNA表達量呈正相關(guān)。雌性黑線倉鼠KiSS-1的調(diào)控途徑在不同漸變光周期下可能存在不同,漸長光周期下主要集中在

10、中樞神經(jīng)處,而漸短光周期和對照光周期時,由于中樞神經(jīng)的褪黑激素抑制作用加強,KiSS-1的調(diào)控作用逐漸向外周調(diào)控途徑轉(zhuǎn)變。在這兩種器官中,GPR54表達變化均與卵巢中KiSS-1的表達方式相近。綜上所述,研究KiSS-1/GPR54對動物繁殖行為的調(diào)節(jié)不能孤立地研究KiSS-1和GPR54的分子結(jié)構(gòu)及其表達量的變化,應結(jié)合與其馴化條件、生理時期綜合考慮。
　　本研究通過實驗室模擬光周期變化與分子生物學研究方法相結(jié)合,從分子的角度初