飼料脂肪酸調控大黃魚免疫力和脂肪酸代謝的初步研究.pdf

1、以我國重要海水肉食性養(yǎng)殖魚類大黃魚（Larmichthys crocea）為研究對象，在海水浮式網(wǎng)箱內(nèi)進行攝食生長實驗，以觀測飼料中脂肪酸水平和組成對大黃魚生長、脂肪酸組成、免疫力、抗病力及相關基因表達的影響，在此基礎上探討飼料脂肪酸調控大黃魚免疫力和脂肪酸代謝的分子機制。本文的研究內(nèi)容和主要研究結果如下：
　　1.飼料中n-3HUFA對大黃魚幼魚生長、非特異性免疫、抗病力以及刺激隱核蟲感染后免疫相關基因表達的影響
　　以初

2、始體重9.79±0.6 g的大黃魚（Larmichthys crocea）為研究對象，在海水浮式網(wǎng)箱（1.0×1.0×1.5 m）內(nèi)進行為期58d的攝食生長實驗，以探討飼料中n-3HUFA對大黃魚幼魚生長、非特異性免疫、TLR22和MyD88相對表達量及抗病力的影響。通過梯度添加DHA油、EPA油和軟脂酸配制等氮等脂的六種飼料（粗蛋白41.3％，粗脂肪11.7%），使飼料中n-3HUFA的含量依次為：0.15、0.60、0.98、1.3

3、7、1.79和2.25%，并使DHA/EPA固定在2.0左右。實驗期間，將六組飼料分別隨機投喂三個網(wǎng)箱的實驗魚（60尾/箱），每天兩次（05:00和17:00）投喂至表觀飽食狀態(tài)。實驗結果表明，適中水平n-3HUFA（0.98%）組特定生長率（SGR）顯著高于對照組（P<0.05），高水平n-3HUFA（1.37%、1.79%和2.25%）會對大黃魚生長產(chǎn)生不利影響，但差異不顯著（P>0.05）。頭腎白細胞NBT陽性比例、血清超氧化物歧

4、化酶（SOD）和溶菌酶活性隨著飼料n-3HUFA水平升高具有先上升后下降的趨勢，其中頭腎白細胞NBT陽性比例和SOD在0.60%組具有最大值，而溶菌酶在1.37%組活性最高。各組間頭腎白細胞的吞噬活性未見明顯趨勢及顯著性差異（P>0.05）。海水刺激隱核蟲感染3d后，各處理組腎臟TLR22 mRNA相對表達量未見顯著性差異（P>0.05），而當飼料中n-3HUFA含量從0.15%增加至0.98%時,MyD88相對表達量顯著升高至2.06

5、，之后隨n-3HUFA水平進一步升高顯著降低至1.36（P<0.05）；而感染海水刺激隱核蟲13d后，各處理組腎臟MyD88 mRNA相對表達量未見顯著性差異（P>0.05），而當飼料中n-3HUFA含量從0.15%增加至0.60%時，腎臟TLR22的相對表達量顯著升高至2.17；而當n-3HUFA含量從0.60%升高至2.25%時，腎臟TLR22的相對表達量顯著降低至1.11（P<0.05）。肝臟TLR22和MyD88 mRNA相對表

6、達量在海水刺激隱核蟲感染3d和13d隨n-3HUFA水平升高均有先升高后下降的趨勢，且表達量最高值出現(xiàn)在0.98-1.79%范圍內(nèi)。海水刺激隱核蟲感染13d后各處理組累計死亡率具有與非特異性免疫和基因表達相似的趨勢，其中0.60%n-3HUFA組累計死亡率最低，顯著低于除0.98%組之外的各處理組。實驗結果表明，0.60%和0.98%n-3HUFA組大黃魚具有最佳免疫力和SGR，低水平和適中水平n-3HUFA具有較高非特異性免疫力、TL

7、R22和MyD88 mRNA相對表達量，說明n-3HUFA可能通過調控TLR22和MyD88 mRNA相對表達量來影響大黃魚SGR、免疫力及其抗病力。
　　2.飼料中DHA/EPA對大黃魚幼魚生長、非特異性免疫、抗病力以及刺激隱核蟲感染后免疫相關基因表達的影響
　　以初始體重9.79±0.6 g的大黃魚（Larmichthys crocea）為研究對象，在海水浮式網(wǎng)箱（1.0×1.0×1.5 m）內(nèi)進行為期58d的攝食生長實

8、驗，以探討飼料中DHA/EPA對大黃魚幼魚生長、非特異性免疫、TLR22和MyD88相對表達量及抗病力的影響。以魚粉、豆粕為主要蛋白源，DHA油、EPA油、ARA油和軟脂酸酯為主要脂肪源配制等氮等脂的五種飼料（粗蛋白41.3%，粗脂肪11.7%），使飼料中DHA/EPA依次為0.61、1.54、2.17、3.04和3.88，且DHA和EPA（n-3HUFA）總量固定在1.08%左右。實驗期間，將五組飼料分別隨機投喂三個網(wǎng)箱的實驗魚（60

9、尾/箱），每天兩次（05:00和17:00）投喂至表觀飽食狀態(tài)。結果表明，大黃魚的特定生長率（SGR）隨 DHA/EPA增大具有先升高后下降的趨勢，當DHA/EPA由0.61升高至2.17時，SGR由2.03%/d顯著升至2.26%/d（P<0.05），當該比例進一步增大時，SGR有下降趨勢，但差異不顯著（P>0.05）。頭腎白細胞NBT陽性比例和血清溶菌酶活性隨著 DHA/EPA升高具有先上升后下降的趨勢，其中頭腎白細胞NBT陽性比例

10、和血清溶菌酶活性分別在2.17和3.04組具有最大值，且均顯著高于對照組和比率為3.88組（P<0.05）。但頭腎白細胞吞噬活性和血清SOD活性在各處理組間未見顯著性差異（P>0.05）。海水刺激隱核蟲感染3d后，各處理組腎臟MyD88 mRNA相對表達量未見顯著性差異；當飼料中DHA/EPA由0.61升高到2.17時，腎臟TLR22 mRNA相對表達量由1.02顯著升至2.47（P<0.05），之后隨 DHA/EPA的增大降至1.73

11、（P>0.05）；肝臟 MyD88相對表達量隨著DHA/EPA的增大具有顯著上升的趨勢，且DHA/EPA為3.88時具有最高值，顯著高于比率為0.61、1.54和2.17處理組（P<0.05）；當飼料中DHA/EPA由0.61升高到3.04時，肝臟TLR22 mRNA相對表達量由1.00顯著升至1.95（P<0.05），之后隨DHA/EPA的增大降至1.51（P>0.05）。刺激隱核蟲感染13d后，各處理組腎臟TLR22和MyD88 m

12、RNA相對表達量均未見顯著性差異（P>0.05）；肝臟TLR22相對表達量隨DHA/EPA升高由1.01顯著降低至0.46（P<0.05）；當飼料中DHA/EPA由0.61升高到2.17時，肝臟MyD88 mRNA相對表達量由1.00顯著升至1.64（P<0.05），之后隨 DHA/EPA的增大降至1.16（P>0.05）。感染刺激隱核蟲13d后大黃魚累計死亡率隨 DHA/EPA增大具有先降低后下降的趨勢，DHA/EPA為1.54、2.

13、17和3.04時累計死亡率較低，顯著低于對照組（P<0.05）。實驗結果表明，DHA/EPA在2.17-3.04之間時，大黃魚生長和整體免疫水平最佳，過高DHA/EPA會降低SGR、非特異性免疫及抗病力，這可能是通過影響TLR22和MyD88相對表達量來實現(xiàn)的。
　　3.豆油為基礎的飼料中添加共軛亞油酸對大黃魚生長、非特異性免疫力、抗氧化能力、脂肪沉積和相關基因表達的影響
　　以初始體重為7.56±0.60g的大黃魚為研究對

14、象，通過攝食生長實驗并利用實時定量PCR技術來探討飼料中共軛亞油酸對大黃魚生長、非特異性免疫力、抗氧化能力、脂肪沉積和相關基因表達的影響。通過梯度添加CLA油，使得飼料中CLA含量依次為0（對照組）、0.42%、0.83%和1.70%飼料干物質。實驗在海水浮式網(wǎng)箱進行，每天兩次投喂，周期為70d。實驗結果表明，大黃魚增重率（WGR）和頭腎巨噬細胞吞噬指數(shù)隨著飼料中CLA的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當飼料中CLA由0升高至0.42%時，

15、WGR由499.30%顯著升高至572.52%，之后隨著飼料中CLA的進一步升高顯著降至444.21%。吞噬指數(shù)在飼料CLA含量為0.42%時具有最高值（34.7%），顯著高于對照組（17.9%）和最高CLA含量組（24.7%）。當飼料中CLA由0升高至0.83%時，頭腎巨噬細胞呼吸爆發(fā)、肝臟過氧化氫酶（CAT）活力和肝臟總抗氧化力（T-AOC）顯著升高，之后隨著CLA的進一步升高顯著下降。其中，呼吸爆發(fā)在0.83%時最高（0.50），

16、顯著高于對照組（0.34）和最高CLA組（0.42）。而肝臟丙二醛（MDA）隨著飼料CLA的升高由3.30顯著降至1.66 nmol/mg protein（P<0.05）。魚體和肌肉脂肪水平隨著飼料中CLA含量的升高而升高（P<0.05）。肝臟和腎臟炎癥相關的基因（環(huán)氧化酶-2和白細胞介素β）和腎臟脂肪酸氧化相關基因（肉堿脂酰轉移酶Ⅰ和乙酰輔酶A氧化酶）的mRNA表達量會隨著飼料中CLA含量的升高而顯著降低。肝臟PPARα和乙酰輔酶A氧

17、化酶的表達隨著飼料中CLA由0.42%升高至1.70%而顯著降低（P<0.05）。上述結果表明飼料中CLA能夠顯著影響大黃魚的生長、非特異性免疫、抗氧化能力及炎性和脂肪酸氧化相關的基因表達，呈現(xiàn)出較為顯著的抗炎、抗氧化效果。這有助于理解CLA在魚類中的具體生理作用。
　　4.飼料中亞麻酸/亞油酸對大黃魚生長、非特異性免疫、抗氧化能力和相關基因表達的影響
　　隨著飼料工業(yè)的發(fā)展，魚油短缺問題日益突出。研究表明，高攝入量的亞油酸

18、（18:2n-6）會嚴重影響海水魚類的生長和免疫性能的發(fā)揮。然而，目前仍不清楚亞油酸的這種不利影響是否能夠通過適當提高ALA/LA的比例來消除。本實驗以初始體重9.56±0.60 g的大黃魚（Larmichthys crocea）為研究對象，在海水浮式網(wǎng)箱（1.0×1.0×1.5 m）內(nèi)進行為期70d的攝食生長實驗，以探討飼料中亞麻酸和亞油酸比例（ALA/LA）對大黃魚生長、非特異性免疫、抗氧化能力及炎性、脂肪酸氧化和合成相關基因表達的

19、影響。對照組飼料含有30%的魚粉和9%的魚油，之后用不同植物油的混合物（亞麻油、葵花油和棕櫚油）替代對照組中78%的魚油，使飼料中ALA/LA的比例依次為：0.03、0.45、0.90和1.51。實驗結果表明，與魚油組相比，高攝入量的亞油酸顯著降低了大黃魚的增重率（WGR）和非特異性免疫力（吞噬指數(shù)、呼吸爆發(fā)和血清溶菌酶活力），然而這種不利影響隨著飼料中ALA/LA的升高至0.45或0.90時得到完全消除。肝臟超氧化物歧化酶（SOD）和

20、過氧化氫酶（CAT）活力在比例為0.45時最高，顯著高于最低或最高比例組。肝臟丙二醛（MDA）含量呈現(xiàn)與SOD和CAT活力相反的變化趨勢，當比例為0.90時魚體肝臟MDA含量最低，顯著低于對照組。肝臟、腎臟和肌肉炎性相關基因（環(huán)氧化酶-2（COX-2），白細胞介素1β（IL-1β）和腫瘤壞子因子α（TNF-α））、脂肪酸氧化相關基因（過氧化物酶體增殖激活受體α（PPARα），肉堿脂酰轉移酶（CPTⅠ）和脂酰CoA氧化酶（ACO））以及脂

21、肪酸合成相關基因（脂肪酸合酶（FAS），蘋果酸脫氫酶（ME）和6磷酸葡萄糖脫氫酶（6GPD））相對mRNA表達量顯著高于對照組，但上述基因表達量在ALA/LA比例為0.45時顯著降至與對照組相似的水平。上述結果表明飼料中ALA/LA能夠顯著影響大黃魚生長、非特異性免疫、肝臟抗氧化能力以及炎性、脂肪酸氧化和合成相關基因表達，比例過高或過低均不利于其生長、免疫和脂肪酸代謝。ALA雖然不是大黃魚的必需脂肪酸，但在抗炎和抗氧化方面卻具有與n-3