小麥孢囊線蟲(chóng)LAMP檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、小麥孢囊線蟲(chóng)是全世界禾谷類(lèi)作物上的重要病原線蟲(chóng)，每年給小麥的生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。小麥孢囊線蟲(chóng)病是我國(guó)小麥生產(chǎn)上的一種新的具有潛在威脅性的線蟲(chóng)病害，嚴(yán)重威脅著我國(guó)的小麥生產(chǎn)安全。禾谷孢囊線蟲(chóng)群體構(gòu)成非常復(fù)雜，目前已知禾谷孢囊線蟲(chóng)組包含12個(gè)有效生物種和一些未知種，不同種類(lèi)的禾谷孢囊線蟲(chóng)對(duì)小麥的致病性有所不同。因此，對(duì)禾谷孢囊線蟲(chóng)種類(lèi)進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定不僅是從事禾谷孢囊線蟲(chóng)研究的基礎(chǔ)，也對(duì)防治小麥孢囊線蟲(chóng)病具有重要意義。
　　 本研

2、究以禾谷孢囊線蟲(chóng)和菲利普孢囊線蟲(chóng)為研究對(duì)象，根據(jù)RAPD特異性片段分別設(shè)計(jì)LAMP引物，建立LAMP檢測(cè)體系，對(duì)反應(yīng)體系中的甜菜堿、Mg2+、dNTPs的濃度以及反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等因素進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行特異性和靈敏度試驗(yàn)，同時(shí)對(duì)田間實(shí)際樣品進(jìn)行鑒定。經(jīng)優(yōu)化后的禾谷孢囊線LAMP反應(yīng)體系為:0.4μmol/L外引物，2.8μmol/L內(nèi)引物，0.4μmol/L環(huán)引物，3.2 mmol/L dNTPs，3mmol/L Mg2+,0.32U/

3、μL BstDNA聚合酶大片段，不添加甜菜堿;菲利普孢囊線蟲(chóng)LAMP反應(yīng)體系為:0.4μmol/L外引物，2.8μmol/L內(nèi)引物，0.4μmol/L環(huán)引物，1.6 mmol/L dNTPs，5 mmol/L Mg2+，0.32 U/μL BstDNA聚合酶大片段，不添加甜菜堿。反應(yīng)程序?yàn)?63℃75 min，85℃10 min。
　　 將單條小麥孢囊線蟲(chóng)（禾谷孢囊線蟲(chóng)和菲利普孢囊線蟲(chóng)）DNA按10倍濃度梯度稀釋?zhuān)⑴c普通PCR

4、方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明本研究建立的LAMP體系檢測(cè)靈敏度達(dá)到1/20000條線蟲(chóng)DNA，比普通PCR靈敏100倍。與常見(jiàn)的植物寄生線蟲(chóng)大豆孢囊線蟲(chóng)、豌豆孢囊線蟲(chóng)、早稻孢囊線蟲(chóng)、香蕉穿孔線蟲(chóng)、象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)等均無(wú)交叉反應(yīng)，說(shuō)明此體系的特異性較強(qiáng)。同時(shí)本研究建立的LAMP檢測(cè)技術(shù)可以用于土壤和受侵染小麥根系的直接檢測(cè)，對(duì)小麥孢囊線蟲(chóng)病的早期診斷具有重要意義。
　　 以上結(jié)果表明，LAMP檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，是鑒定禾谷孢囊線蟲(chóng)