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1、不同直鏈含量的淀粉在食品、醫(yī)療、工業(yè)、環(huán)境保護(hù)等行業(yè)中都有廣泛的應(yīng)用。水稻在全世界種植面積大,產(chǎn)量高。因此,培育不同直鏈淀粉含量的水稻品種意義重大。水稻中直鏈淀粉合成相關(guān)的基因主要有OsgbssⅠ和OsgbssⅡ兩個(gè)基因,OsgbssⅠ基因主要與胚乳等存儲(chǔ)型器官中直鏈淀粉的合成有關(guān),研究比較詳細(xì)。而OsgbssⅡ基因主要在莖、葉片等光合組織臨時(shí)性存儲(chǔ)淀粉的器官中合成直鏈淀粉,對(duì)該基因的研究相對(duì)較少,該基因的功能及作用特征還未完全明了。本
2、論文從水稻中克隆并構(gòu)建了OsgbssII基因的植物表達(dá)載體,對(duì)轉(zhuǎn)OsgbssII基因水稻的基因表達(dá)及淀粉含量等表型進(jìn)行了分析,初步結(jié)果如下:
1.不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下OsgbssII基因在水稻中的表達(dá)及轉(zhuǎn)基因株系表型
對(duì)3個(gè)過(guò)表達(dá)載體和1個(gè)反義載體轉(zhuǎn)基因T3代純合株系種子發(fā)育過(guò)程中OsgbssII基因表達(dá)定量分析顯示:由胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子SBE IIb驅(qū)動(dòng)的gbssII和玉米Ubi啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的gbssII轉(zhuǎn)基因水稻的幼嫩
3、種子中,gbssII基因表達(dá)量在花后6d時(shí)分別是同期對(duì)照的2倍和3倍,12d時(shí)分別是對(duì)照的14倍和23倍,均達(dá)到極顯著差異水平;轉(zhuǎn)Gt1-gbssⅡ株系幼嫩種子中,gbssⅡ基因表達(dá)量在花后6d、12d時(shí)分別是同期對(duì)照的2倍和7倍,顯著高于對(duì)照,但未達(dá)到極顯著差異水平;轉(zhuǎn)Ubi-gbssII株系倒二葉片中g(shù)bssⅡ基因表達(dá)量在花后各時(shí)期均顯著高于Ubi-antigbssⅡ株系和對(duì)照,其中花后6d時(shí)是對(duì)照的5倍,達(dá)到高峰。反義表達(dá)的Ubi
4、-antigbssⅡ株系葉片中g(shù)bssⅡ基因表達(dá)量在各時(shí)期較對(duì)照有所降低,但未達(dá)到顯著差異水平。
對(duì)花后3d、6d、12d時(shí)幼嫩種子中直鏈淀粉占總淀粉百分含量的測(cè)定結(jié)果顯示:Ubi-gbssⅡ株系在3d和6d時(shí)較同期對(duì)照分別提高了53.2%、55.5%,達(dá)到極顯著差異水平;IIb-gbssⅡ株系在花后6d時(shí)比對(duì)照提高了41.1%,達(dá)到顯著差異水平;轉(zhuǎn)Gt1-gbssⅡ株系較對(duì)照有所提高,轉(zhuǎn)Ubi-antigbssⅡ株系較對(duì)照有
5、所降低,但都未達(dá)到差異顯著水平。
成熟種子中直鏈淀粉含量分析顯示:轉(zhuǎn)IIb-gbssⅡ株系和Ubi-gbssⅡ株系較對(duì)照分別提高2.98%、5.8%,達(dá)到顯著和極顯著差異水平;轉(zhuǎn)Gt1-gbssⅡ株系和Ubi-antigbssⅡ株系較對(duì)照分別提高1.64%和降低1.33%,均未達(dá)到差異顯著水平。
對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻成熟種子淀粉顆粒形態(tài)分析顯示:轉(zhuǎn)IIb-gbssⅡ、Ubi-gbssⅡ株系的淀粉粒顆粒形態(tài)較對(duì)照小,有明顯的晶
6、體棱角,排列致密;而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏牡矸哿S写?、小兩種不同的顆粒形態(tài),排列疏松,表面光滑;轉(zhuǎn)Gt1-gbssⅡ株系中大多數(shù)淀粉粒聚合在一起形成簇狀結(jié)構(gòu),還有少數(shù)淀粉粒游離于簇之間。
2.構(gòu)建OsgbssⅠ、OsgbssⅡ基因啟動(dòng)子互換過(guò)表達(dá)載體和RNAi干擾載體,進(jìn)一步分析OsgbssⅡ基因的作用。
構(gòu)建了OsgbssⅠ、OsgbssⅡ基因啟動(dòng)子互換過(guò)表達(dá)載體和RNAi干擾載體3個(gè),分別是:1301-OsgbssⅠp-
7、OsgbssⅠRNAi-OsgbssⅠp-OsgbssⅡ,1301-OsgbssⅡp-OsgbssⅡRNAi-OsgbssⅡp-OsgbssⅠ,1301-OsgbssⅠp-OsgbssⅠRNAi-OsgbssⅡp-OsgbssⅡRNAi,并用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法分別獲得轉(zhuǎn)基因克隆43個(gè)、46個(gè)和41個(gè)。
對(duì)轉(zhuǎn)3個(gè)載體T0代植株的OsgbssⅠ、OsgbssⅡ基因表達(dá)定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)1301-OsgbssⅡp-OsgbssⅡRNAi-O
8、sgbssⅡp-OsgbssⅠ株系在花后0d、3d、6d、12d時(shí),倒二葉片中g(shù)bssⅠ基因表達(dá)量分別是同期對(duì)照的25倍、1578倍、625倍、220倍,差異均極顯著;而轉(zhuǎn)另2個(gè)載體株系及對(duì)照葉片中g(shù)bssⅠ基因表達(dá)量在各時(shí)期均幾乎為0;表明OsgbssⅡp啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)了OsgbssⅠ基因在葉片中表達(dá),同時(shí)表明水稻內(nèi)源OsgbssⅠp啟動(dòng)子不能驅(qū)動(dòng)OsgbssⅠ基因在葉片中表達(dá)。
轉(zhuǎn)基因成熟種子中直鏈淀粉含量測(cè)定結(jié)果顯示:Osg
9、bssⅡp驅(qū)動(dòng)OsgbssⅠ基因表達(dá)的轉(zhuǎn)1301-OsgbssⅡp-OsgbssⅡRNAi-OsgbssⅡp-OsgbssⅠ株系成熟種子的直鏈淀粉含量最高,較對(duì)照提高3.58%;OsgbssⅠ、OsgbssⅡ兩個(gè)基因都被干擾的轉(zhuǎn)1301-OsgbssⅠp-OsgbssⅠRNAi-OsgbssⅡp-OsgbssⅡRNAi株系最低,較對(duì)照降低6.91%;均未達(dá)到顯著差異水平。
3.構(gòu)建OsgbssⅡ基因原核表達(dá)載體,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)
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