BmNPV DNA結(jié)合蛋白GP88對(duì)病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、眾所周知，通過基因敲除的方法研究桿狀病毒基因的功能是一種很有效的手段，特別是探究基因在病毒感染周期中對(duì)病毒復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響方面尤為突出。GP88蛋白是家蠶桿狀病毒(BmNPV)基因組中的一種DNA結(jié)合蛋白，被認(rèn)為是一種病毒基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，然而，在病毒DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄過程中GP88蛋白是否起著某種調(diào)節(jié)作用還未可知。在這項(xiàng)工作中，我們運(yùn)用Red重組技術(shù)敲除了BmNPV的gp88基因，構(gòu)建了gp88缺失型病毒gp88-ko-Bacm

2、id;再利用Bac-to-Bac技術(shù)構(gòu)建了gp88補(bǔ)回型病毒gp88-re-Bacmid，再將三種病毒Bacmid（wtBacmid、gp88-ko-Bacmid和gp88-re-Bacmid）DNA轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，gp88缺失型病毒TCID5o為零，而gp88修復(fù)型病毒的TCID5o則與野生型基本相同(p＞0.05)，這說明gp88基因缺失會(huì)導(dǎo)致不能形成具有感染活性的病毒粒子。為了深入了解GP88的生物學(xué)功能，我們利

3、用熒光定量PCR技術(shù)分析了三種病毒Bacmid轉(zhuǎn)染細(xì)胞后病毒基因組DNA的復(fù)制情況以及病毒早期、晚期和極晚期基因的轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果顯示，缺失gp88基因后，病毒基因組DNA的復(fù)制水平較野生型和補(bǔ)回型病毒均顯著降低(p＜0.05);病毒早期基因lef-3、ie-1和dnapol，晚期基因vp39與極晚期基因p10的轉(zhuǎn)錄水平相比較修復(fù)型與野生型病毒而言均有顯著降低(p＜0.05)。WesternBlot檢測顯示gp88基因的缺失會(huì)導(dǎo)致LEF3

4、、VP39以及P10基本不表達(dá)，而野生型和gp88補(bǔ)回型病毒則檢測到上述三種蛋白表達(dá)。透射電鏡檢測結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了gp88基因缺失后，細(xì)胞內(nèi)無成熟的病毒粒子形成，而gp88基因修復(fù)后，電鏡觀察的情況與野生型病毒相似，有大量成熟的病毒粒子產(chǎn)生。綜上研究結(jié)果表明:gp88基因的缺失會(huì)導(dǎo)致BmNPV基因組復(fù)制水平顯著降低;敲除gp88后會(huì)導(dǎo)致BmNPV各時(shí)期基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致病毒早期、晚期和極晚期蛋白表達(dá)水平顯著降低或不表