鵝TLR3和TLR5基因的克隆及其功能研究.pdf

1、傳染病的頻繁暴發(fā)嚴(yán)重制約養(yǎng)鵝業(yè)發(fā)展，主要原因是對其抗感染免疫機(jī)理知之甚少和防疫技術(shù)落后。系統(tǒng)研究 Toll樣受體（TLRs）在抗感染免疫過程中的作用不僅能為全面闡明鵝的免疫機(jī)理奠定基礎(chǔ)，還為品種（品系）的優(yōu)選及分子育種提供理論依據(jù)。本研究：利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(Smart RACE)分別獲得鵝TLR3和TLR5的cDNA全長，預(yù)測其分子結(jié)構(gòu)特征；設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，檢測TLR3和TLR5在各組織器官

2、的表達(dá)；構(gòu)建真核表達(dá)載體與雙熒光報告基因系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過特異性配體刺激檢測TLRs激活對核因子-B的活性影響；通過熒光定量PCR檢測不同微生物（配體）刺激鵝外周血單核細(xì)胞后TLRs及其下游炎性因子mRNA表達(dá)量的變化。研究結(jié)果表明：
　?。?）鵝TLR3 cDNA序列全長2874bp，包括149bp的5′非編碼區(qū)、34bp的3′非編碼區(qū)和編碼896個氨基酸的2691bp的開放閱讀框，分子量為102.13kDa、PI

3、為8.53。TLR3全長氨基酸序列包含1個信號肽、14個富含亮氨酸的重復(fù)序列(Leucine-rich Repeat，LRR)、1個跨膜結(jié)構(gòu)域和1個胞內(nèi) TIR結(jié)構(gòu)域(IL-R1 homologous region, TIR)。同源比對顯示，與雞TLR3具有較高的同源性(84.4％)。組織表達(dá)結(jié)果表明，TLR3在健康鵝的組織中分布廣泛，其中在胰腺、脾臟和十二指腸中表達(dá)量最高。雙熒光報告結(jié)果表明，鵝TLR3能在Poly i:c的刺激下引起

4、NF-?B的活化。禽流感病毒（H5N1）刺激鵝外周血單核細(xì)胞（PBMC）后，能引起TLR3、IL-6和IFN-?的mRNA表達(dá)顯著增加，而Poly i:c僅能引起TLR3和IFN-?的mRNA上調(diào)，且兩種刺激物均無法上調(diào)IL-1?的mRNA表達(dá)量。相關(guān)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLR3的表達(dá)量與IFN-?mRNA表達(dá)量為正相關(guān)。
　　（2）鵝TLR5cDNA序列全長2967bp，包括215bp的5′非編碼區(qū)、384bp的3′非編碼區(qū)和編碼860

5、個氨基酸的2583bp的開放閱讀框，分子量為98.88kDa、PI為6.34。TLR5全長氨基酸序列包含1個信號肽、7個富含亮氨酸的重復(fù)序列、1個跨膜結(jié)構(gòu)域和1個胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域。同源比對顯示，與雞TLR5的同源性最高（81.3%）。組織表達(dá)分析顯示，TLR5在健康鵝的組織中具有較廣的表達(dá)分布，其中在腎臟和脾臟組織中表達(dá)量最高。雙熒光報告結(jié)果表明，鵝TLR5能在鞭毛蛋白（Flagellin）的刺激下引起NF-?B活化。沙門氏菌和鞭毛蛋白