家蠶BmN培養(yǎng)細(xì)胞晝夜節(jié)律生物鐘基因的表達(dá)特征.pdf

1、生物鐘是昆蟲生命周期中的重要的調(diào)控機(jī)制，對昆蟲的各種行為活動，激素代謝都有重要的調(diào)節(jié)作用。生物鐘普遍存在于生物界從人類到藍(lán)藻的各種物種，從生物體到組織、細(xì)胞的各種生物層次。體外培養(yǎng)細(xì)胞和組織雖然脫離了生物體中樞神經(jīng)的調(diào)控，也具備信號接收器、節(jié)律振蕩系統(tǒng)和輸出系統(tǒng)三大生物鐘原件。
　　家蠶中生物鐘的研究主要集中在個體水平，研究內(nèi)容此前主要是探討滯育與生物鐘的關(guān)聯(lián)。本文利用家蠶細(xì)胞培養(yǎng)系BmN，運(yùn)用qPCR、Western blott

2、ing、免疫細(xì)胞化學(xué)、RNAi等技術(shù)手段，研究了生物鐘調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中Cry1、Cry2、Per、Tim、Clk和Cyc基因在光制和溫度振蕩變化下的表達(dá)特征。結(jié)果如下：
　　1.家蠶BmN細(xì)胞中存在著內(nèi)源的生物鐘系統(tǒng)
　　家蠶BmN細(xì)胞中生物鐘基因Cry1、Cry2、Per、Tim、Clk和Cyc的表達(dá)能夠響應(yīng)光照和溫度刺激，對光制和溫度振蕩也產(chǎn)生了節(jié)律響應(yīng)，多克隆抗體檢測出BmN細(xì)胞中CRY1、CRY2、PER和TIM蛋白質(zhì)的存

3、在及光照對CRY1、CRY2、PER、TIM蛋白質(zhì)的表達(dá)影響。表明家蠶BmN細(xì)胞中存在內(nèi)源生物鐘系統(tǒng)，可以將家蠶BmN作為研究家蠶生物鐘作用機(jī)制的模型。
　　2.溫度對光照恒定時的家蠶BmN生物鐘有補(bǔ)償作用
　　在25℃恒明（25LL）環(huán)境中，BmN細(xì)胞中Cry1、Cry2、Per、Tim、Clk和Cyc基因的表達(dá)量降低，振蕩節(jié)律減弱甚至消失；在此條件下，溫度發(fā)生振蕩（20：30LL）后，Cry1、Cry2、Per、Tim、

4、Clk和Cyc基因的表達(dá)量上升，恢復(fù)了節(jié)律振蕩。表明家蠶BmN細(xì)胞生物鐘信號輸入途徑對溫度授時因子具有響應(yīng)，并且對恒明條件下家蠶BmN細(xì)胞的生物鐘系統(tǒng)起一定的補(bǔ)償作用。
　　3.BmN細(xì)胞中的Cry1和Cry2基因?qū)庑盘柡蜏囟刃盘柕捻憫?yīng)存在差異
　　Cry1基因的表達(dá)在光照刺激后出現(xiàn)顯著的上調(diào)變化。不同光節(jié)律下，Cry1和Cry2對光照變化都十分敏感，但Cry1的表達(dá)量顯著高于Cry2（P<0.05）；在光照黑暗交替的瞬間

5、，Cry1表達(dá)量下調(diào)，而Cry2沒有明顯變化。推測Cry1在家蠶BmN細(xì)胞光節(jié)律調(diào)控的核心振蕩器中對光節(jié)律作出響應(yīng)，即具有光信號受體作用的可能。溫度刺激使Cry2基因的表達(dá)表現(xiàn)出極顯著變化；溫度振蕩節(jié)律下，Cry1的振蕩節(jié)律紊亂，而Cry2的振蕩節(jié)律表現(xiàn)出對溫度變化及時的響應(yīng)以及很強(qiáng)的規(guī)律性。推測Cry2是溫度節(jié)律調(diào)控的振蕩器中的信號接受因子。
　　4.Per基因在家蠶生物鐘環(huán)路中的作用可能比Cry1基因更大
　　本實驗室早

6、期對PER蛋白結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)分析顯示，家蠶PER蛋白與TIM一樣，具有蛋白質(zhì)信號傳導(dǎo)互作基序位點，家蠶PER是以蛋白質(zhì)形式在生物鐘環(huán)路中發(fā)揮信息傳遞作用。本實驗室早期在個體水平和本文在細(xì)胞水平對Cry1的實驗結(jié)果都提示，家蠶CRY1是作為光信號受體發(fā)揮作用。本文進(jìn)一步干涉Cry1和Per中的任意一個基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)另一個基因的表達(dá)都會受到顯著影響。干涉Cry1基因，只有Per和Cyc的表達(dá)量發(fā)生了變化；而干涉Per后，幾乎所有調(diào)查基因都