家兔促卵泡激素β(FSHβ)基因克隆及表達(dá)研究.pdf

1、促卵泡激素是由動(dòng)物垂體前葉嗜堿性細(xì)胞合成并分泌的一種糖蛋白激素，由α和β亞基組成，而β亞基是激素生物活性和免疫活性的決定因素。促卵泡激素β亞單位由FSHβ基因編碼，前人的研究表明，F(xiàn)SHβ基因多態(tài)性與動(dòng)物多產(chǎn)性有密切關(guān)聯(lián)性，該基因是影響動(dòng)物產(chǎn)仔數(shù)的主效基因之一。本研究以新西蘭白兔為研究對(duì)象，采用基因克隆、原核表達(dá)和Real-time PCR等方法研究家兔FSHβ基因的在原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)情況，制備抗家兔FSHβ多克隆抗體，并對(duì)FSHβ

2、基因在家兔卵巢、輸卵管、子宮、睪丸和輸精管等生殖器官中的表達(dá)差異進(jìn)行了分析。主要結(jié)果如下:
　　1.本研究參考GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中日本大耳兔FSHβ基因的mRNA序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，對(duì)新西蘭白兔FSHβ基因進(jìn)行克隆、序列分析，并將其與其它物種的FSHβ基因CDS序列和編碼氨基酸序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果表明，克隆得到的CDS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列完全一致，核苷酸序列與其它哺乳動(dòng)物的同源性較高(86.4％～89.7％)，

3、但與禽類、魚(yú)類的同源性較低，分別為74.1％和53.3％。基于FSHβ基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，可知家兔與人、黑猩猩的親緣關(guān)系較近，聚類分析結(jié)果與生物學(xué)分類結(jié)果基本一致。
　　2.PCR擴(kuò)增FSHβ基因去信號(hào)肽序列，并成功構(gòu)建了去信號(hào)肽FSHβ基因的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-FSHβ，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、超聲波破碎菌體、SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)，得到大小約為42kDa的融合蛋白，而且重組表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3

4、)中的表達(dá)產(chǎn)物主要是以包涵體形式存在的，將得到的包涵體融合蛋白純化后免疫小鼠，分離小鼠血清，得到FSHβ多克隆抗體，對(duì)多克隆抗體進(jìn)行ELISA和Western Blot檢測(cè)，結(jié)果表明抗體的效價(jià)為1∶256000，特異性較好。
　　3.對(duì)FSHβ基因在9～23周齡家兔的卵巢、輸卵管、子宮、睪丸和輸精管等生殖器官中的表達(dá)水平進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，F(xiàn)SHβ基因在5個(gè)生殖器官中均有表達(dá)，13周齡各組織間表達(dá)量差異不顯著(P