枇杷種質限制生長保存及乙烯代謝與信號轉導相關基因等克隆及表達.pdf

1、本試驗首先以“早鐘6號”枇杷為材料，進行胚培養(yǎng)及其試管苗保存條件的優(yōu)化研究，并離體保存了21份枇杷資源的試管苗；同時，以“早鐘6號”試管苗葉片為材料，克隆得到乙烯信號轉導相關基因ETR、ERS以及抗氧化相關基因CAT的cDNA全長序列，并以枇杷試管苗離體保存不同時期葉片為材料，進行ETR、ERS、CAT等3個基因及本實驗室音建華（2010）已克隆的2個基因ACS和ACO在離體保存過程中表達量的qPCR分析。主要研究結果如下：
　　

2、1、枇杷胚培養(yǎng)及試管苗的獲得
　　以早鐘6號枇杷幼胚為材料，研究不同濃度GA3及光質對幼胚萌發(fā)率的影響。不同濃度GA3對幼胚的萌發(fā)影響較大，其中1/2 MS+0.2 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1 GA3的萌發(fā)率最高；不同光質對枇杷幼胚對幼胚萌發(fā)率影響不大，紅光、藍光均促進幼胚萌發(fā)。在枇杷成熟胚培養(yǎng)中，6-BA對枇杷成熟胚萌發(fā)率影響最大，NAA影響最小，適合的萌發(fā)培養(yǎng)基為MS+0.5 mg

3、·L-12,4-D+1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA。
　　2、枇杷試管苗的增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)
　　將枇杷幼胚萌發(fā)得到的試管苗，接入添加不同濃度的TDZ或KT的增殖培養(yǎng)基中，研究TDZ或KT對枇杷試管苗增殖的影響。結果發(fā)現(xiàn)適合枇杷試管苗增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+0.1 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 TDZ或MS+0.1 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 KT。最適合的生根培養(yǎng)基為

4、0.5 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1IBA+1/2 MS，生根率為93.095%。
　　3、21份枇杷種質資源試管苗的離體保存研究
　　本試驗將枇杷試管苗接入1/3 MS+4.0 mg·L-1PP333培養(yǎng)基上，分別置于4種不同光質下培養(yǎng)，探討不同光質對試管苗離體保存的影響。紅光有利于枇杷試管苗的離體保存，枇杷試管苗在紅光條件下，離體保存效果較好，保存11個月時，試管苗存活率仍有70%以上。另外，收集21份枇杷資

5、源，將枇杷胚接種在1/2 MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，并直接對21份枇杷資源進行離體保存，21份枇杷種質資源離體保存存在差異。
　　4、枇杷試管苗葉片乙烯受體基因ETR基因的克隆
　　以枇杷試管苗葉片為材料，采用同源克隆方法得到3條ETR1 cDNA全長序列，分別命名為Ej-ETR1a、Ej-ETR1b、Ej-ETR1c，編碼相同的741個氨基酸；4條ETR2 cDNA全長序列，分別命名為 Ej-ETR2a、Ej-ETR2b、Ej-E

6、TR2c、Ej-ETR2d，編碼相同的741個氨基酸。各基因cDNA序列GenBank檢索號分別為JX307084、JX307087、JX996185、JX307089、JX307090、JX307091、KC709505。根據(jù)生物信息學分析，推測兩類ETR蛋白均是不穩(wěn)定的疏水性蛋白，不含信號肽；在N-端疏水區(qū)存在3個跨膜區(qū)，屬于跨膜蛋白；有一個螺旋卷曲結構，亞細胞定位于細胞膜中，具有8個保守結構域，均屬于ethylene sensor

7、家族；ETR1蛋白具有30個功能位點，32個磷酸化位點，ETR2蛋白有28個功能位點，35個磷酸化位點，兩個基因的氨基酸序列相似性為95.28%，均屬于乙烯受體ETR1亞家族
　　5、枇杷試管苗葉片乙烯受體基因ERS基因的克隆
　　從枇杷試管苗葉片中克隆得到1條ERS cDNA序列，全長2170 bp，編碼673個氨基酸， GenBank檢索號為JX307088。對該蛋白進行生物信息學分析，推測該蛋白為不穩(wěn)定的疏水性蛋白，不

8、含信號肽，亞細胞定位于細胞膜；除了近N-端的3個跨膜區(qū)域外，Ej-ERS蛋白還有294-315 aa及320-341aa兩處跨膜區(qū)；該蛋白有1個螺旋卷曲結構，28個功能位點，26個磷酸化位點，與枇杷ETR1、ETR2同屬于乙烯受體ETR1亞家族。
　　6、枇杷試管苗葉片CAT基因的克隆
　　采用同源克隆方法，從枇杷試管苗葉片中得到6條CAT cDNA序列全長，其中1條CAT1序列、5條CAT2序列，分別命名為Ej-CAT1、

9、Ej-CAT2、Ej-CAT2-2、Ej-CAT2-3、Ej-CAT2-4、Ej-CAT2-5。GenBank檢索號分別為：JX307086、JX307085、JX996184、JX996186、JX996187、JX996188。對CAT1及CAT2推到的氨基酸進行生物信息學分析，兩個蛋白均編碼492個氨基酸，是親水蛋白，不含信號肽，不存在螺旋卷曲結構，是非跨膜蛋白，亞細胞定位于過氧化物酶體；CAT1及CAT2蛋白分別有18、17個功

10、能位點，22、19個磷酸化位點，是以Ser為主，Thr、Tyr為輔發(fā)生磷酸化反應。
　　7、枇杷試管苗離體保存過程中乙烯代謝與信號轉導相關基因等表達的qPCR分析
　　本試驗以在1/3MS+4.0 mg·L-1 PP333培養(yǎng)基上離體保存的不同時期枇杷試管苗葉片為材料，以Actin為內(nèi)參基因，采用qPCR方法分析枇杷乙烯代謝與信號轉導相關基因ETR、ERS、ACS、ACO以及抗氧化相關基因 CAT在離體保存過程中的表達規(guī)律。

11、結果表明：5個基因在6個不同保存時期均有表達。其中，ETR基因整體表達量先降低后上升，最后趨向平穩(wěn)，保存1個月時表達量最高，保存5個月表達量最低；ERS基因表達量呈“W”狀，保存7個月表達量最高，保存5個月時表達量相對最低；ACS基因表達量變化較復雜，整體趨勢先上升后下降，之后又有所上升，最后又開始下降直至降到最低值（保存11個月）；ACO基因的表達量在保存1個月及4個月時較高，其后的4個時期表達量沒有明顯變化；而CAT基因表達量的整體

12、趨勢呈字母“W”形狀，保存1個月時表達量最高，7個月時表達量最低。
　　在枇杷試管苗離體保存的整個過程中，乙烯受體基因ETR、ERS與ACS表達模式基本相似，但在保存4個月、11個月時ACS表達量與受體基因表達量變化趨勢相反，4個月ACS表達量增加，而受體基因的表達量則降低；11個月時，ACS表達量下降，ETR、ERS表達量則略升。枇杷ACO基因除了在4、7個月表達量動態(tài)變化不一致外，其余幾個時期的變化規(guī)律幾乎與ETR、ERS表達

13、量變化趨勢類似。
　　ACS與ACO表達量動態(tài)變化趨勢基本一致，且ACS每個時期表達量均高于ACO的表達量。前2個時期表達量增加，可能是由于試管苗生長發(fā)育進入葉片成熟和衰老階段，乙烯合成量增加；而在離體保存后4個時期，試管苗新的側芽開始生長，抽出新的枝葉，并慢慢發(fā)育成熟，但ACO表達量卻無明顯變化，乙烯生成量趨于穩(wěn)定，這可能跟乙烯受體表達量變化有關。ACS處于ACO的上游，每個時期的ACS基因的表達量均高于ACO基因的表達量，說明