黃河三角洲濱海濕地放線菌多樣性及活性潛力評(píng)估.pdf

1、黃河三角洲地處中國(guó)暖溫帶，自然資源和生物資源豐富。但同時(shí)，由于淡水水源供給不足，加上海陸的共同作用，導(dǎo)致水鹽的平衡失調(diào)，土壤鹽堿化程度加重。該濕地的放線菌為了適應(yīng)鹽堿環(huán)境，可能存在獨(dú)特的適應(yīng)模式以及分子調(diào)節(jié)機(jī)制，很有可能會(huì)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的次級(jí)代謝產(chǎn)物。因此，研究黃河三角洲濱海濕地放線菌多樣性對(duì)于放線菌資源的開發(fā)和持續(xù)利用具有重大的理論及實(shí)踐意義。
　　采用非培養(yǎng)技術(shù)分析了黃河濱海濕地環(huán)境中放線菌的多樣性，對(duì)來自黃河三角洲濱海濕地四個(gè)

2、位點(diǎn)的土壤樣品構(gòu)建16S rDNA克隆文庫(kù)。16S rDNA序列的測(cè)序結(jié)果表明，位點(diǎn) BZ10的放線菌類群最多，分布于15個(gè)屬中；位點(diǎn) DY14次之，包括12個(gè)放線菌屬；位點(diǎn)DY40得到9個(gè)放線菌屬；位點(diǎn)BZ25獲得的放線菌類群最少，僅得到3個(gè)不同屬。綜合四個(gè)位點(diǎn)分析，黃河三角洲濱海濕地存在豐富的放線菌多樣性，主要分布于放線菌綱（Actinobacteria）和酸微菌綱（Acidimicrobiia）的9個(gè)亞目中，分屬于10個(gè)科，共包括

3、了22個(gè)屬。還有一些不能確定分類地位的類群，有可能代表新的放線菌類群。
　　采用常規(guī)培養(yǎng)方法對(duì)包括上述四個(gè)位點(diǎn)在內(nèi)的10個(gè)位點(diǎn)的樣品進(jìn)行了放線菌分離培養(yǎng)，分別采用高氏一號(hào)、改良淀粉酪素、ISP5、甘油-精氨酸、GW1、丙酸鈉、M3和改良高氏一號(hào)共8種培養(yǎng)基，以制霉菌素、萘啶酮酸鈉和重鉻酸鉀作為抑制劑，共分離得到165株放線菌。通過表觀形態(tài)排重可分屬于8個(gè)類群：白孢類群、黃色類群、粉紅孢類群、粉紅紫類群、青色類群、燼灰類群、灰褐類群

4、、金色類群。每種類群中挑選形態(tài)不同的菌株（每種形態(tài)挑選2株）進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，結(jié)果表明，分離得到的菌株共分布于12個(gè)屬，主要為Streptomyces屬和Nocardiopsis屬，還有一些稀有菌屬，其中包括1株Agromyces屬潛在新種。與非培養(yǎng)獲得的放線菌多樣性信息相比較發(fā)現(xiàn)，兩種技術(shù)獲得的放線菌多樣性信息差異較大，由于分離培養(yǎng)技術(shù)的限制，環(huán)境中大多數(shù)的放線菌目前還不能被分離培養(yǎng)，非培養(yǎng)獲得的放線菌多樣性遠(yuǎn)多于純培養(yǎng)獲得菌

5、株類群。
　　對(duì)分離菌株合成活性次級(jí)代謝物的潛力進(jìn)行了考察。分別采用 K1F/M6R、FW/RV和 A3F/A7R三對(duì)兼并引物進(jìn)行 I型聚酮合酶（PKS-I）、II型聚酮合酶（PKS-II）和非核糖體肽合成酶（NRPS）功能基因的篩選。其中，有9株放線菌含有I型聚酮合酶基因，有11株放線菌含有II型聚酮合酶基因，有6株菌含有非核糖體肽合成酶基因。部分菌株功能基因的氨基酸序列與 GenBank已知化合物基因序列的最大同源性較低，預(yù)示

6、具有合成結(jié)構(gòu)新穎的化合物的潛力。
　　挑選具有代表性的分離菌株進(jìn)行抑菌活性的初步探索。采用的方法為瓊脂塊擴(kuò)散法，選擇了9株指示菌：鰻弧菌、溶藻膠弧菌、副溶血弧菌、白色假絲酵母菌、銅綠假單胞菌、鮑曼氏不動(dòng)桿菌（編號(hào)11927）、鮑曼氏不動(dòng)桿菌（編號(hào)11910）、MRSA（甲氧苯青霉素抗性金黃色葡萄球菌）、MRCNS（甲氧苯青霉素抗性凝固酶陰性葡萄球菌）。共得到22株能夠產(chǎn)生抑菌圈的菌株，包括9株鏈霉菌、8株擬諾卡氏菌和5株芽孢桿菌。

7、除了白色假絲酵母菌和銅綠假單胞菌外，其他的指示菌都能被分離得到的某些菌株抑制，而產(chǎn)生大小不等的抑菌圈，其中菌株OAct388表現(xiàn)出的抑菌效果最好，對(duì)6株指示菌有抑制作用；菌株OAct363對(duì)5株指示菌具有抑菌作用。
　　本論文的研究結(jié)果表明，黃河三角洲濱海濕地蘊(yùn)藏著豐富的放線菌資源，分離得到的很多菌株為I型聚酮合酶、II型聚酮合酶或非核糖體肽合成酶的潛在生產(chǎn)菌株，同時(shí)，抑菌活性實(shí)驗(yàn)也顯示出很多菌株具有良好的抑菌活性。非培養(yǎng)技術(shù)與可