BVDV RT-LAMP檢測方法的建立及BRV和BVDV二聯(lián)滅活疫苗的初步研制.pdf

1、牛輪狀病毒(BovineRotavirus，BRV)是呼腸孤病毒科(Reoviridae)輪狀病毒屬(Rotavirus)的病毒，牛病毒性腹瀉病毒(Bovineviraldiarrheavirus，BVDV)是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的病毒，二者都可以造成犢牛的腹瀉。另外，BVDV還是引發(fā)繁殖障礙、粘膜病、持續(xù)性感染等疾病的病原。近年來，BRV和BVDV對于全球養(yǎng)牛業(yè)造成了極大的危害，嚴(yán)重阻礙

2、了養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。
　　 本研究首先從犢牛的腹瀉物中分離出兩株BVDV的保定地方株，分別以BD-2和BD-4為其命名。將分離株在MDBK細胞上傳20代，對F1和F20代細胞毒測序鑒定，分析其基因變異程度;同時利用TCID50對F1、F10和F20代細胞毒的毒力進行測定，從而選取了更為穩(wěn)定的BD-2株作為疫苗株。
　　 同時，針對BD-2編碼gP48蛋白的基因序列應(yīng)用PrimerExplorerV4軟件，對該基因序列的保守區(qū)

3、設(shè)計了4條RT-LAMP引物，旨在建立一種針對編碼gP48蛋白基因序列的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(RT-LAMP)的快速檢測方法。優(yōu)化了反應(yīng)體系、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間，檢測了該方法的特異性和靈敏度。結(jié)果表明，該方法在等溫條件下只需要40min就能檢測出結(jié)果，與普通RT-PCR方法相比更加省時，且在判定檢測結(jié)果時無需昂貴的儀器設(shè)備，具有高特異性、高靈敏度、操作簡便快速等特點，適合于基層臨床檢測的應(yīng)用。
　　 實驗室保存的BRVRV+株在

4、Marc-145上傳20代，亦對F1和F20代細胞毒測序鑒定，分析其基因變異程度;同時利用TCID50對其F1、F10和F20代細胞毒的毒力進行測定，發(fā)現(xiàn)該株BRV穩(wěn)定性良好，可以作為疫苗株使用。然后，選取TCID50適宜的RV+株F1代毒和BD-2株F5代毒滅活，制成BRV和BVDV二聯(lián)油乳劑滅活疫苗。對于研制出的二聯(lián)滅疫活苗在昆明系小白鼠上進行安全性和免疫效力的實驗室初步檢測。結(jié)果顯示，對小鼠的保護率達93.3％，并且安全性良好。<