馬鈴薯瘡痂病菌分子檢測(cè)技術(shù)的建立.pdf

1、馬鈴薯瘡痂病(Potato scab)是馬鈴薯生產(chǎn)上的重要經(jīng)濟(jì)性病害，該病可由多種植物病原鏈霉菌(Steptomyces spp.)引起。由于其病原菌組成多樣，給病原菌的檢測(cè)帶來(lái)較大困難。隨著各種PCR技術(shù)的發(fā)展及在其他病害檢測(cè)中的成熟應(yīng)用，為探索馬鈴薯瘡痂病原菌的分子檢測(cè)方法提供了有益借鑒。本研究在前期獲得的不同致病菌株基礎(chǔ)上，通過(guò)篩選通用特異性檢測(cè)引物和反應(yīng)體系確立瘡痂病菌的定性檢測(cè)方法，并結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)摸索病原菌的定量檢測(cè)

2、方法，所得結(jié)果如下:
　　 1.馬鈴薯瘡痂病菌定性檢測(cè):根據(jù)瘡痂病菌特有的毒素合成基因簇中的基因txtA、txtB、txtC(P450)、txtD（nos）序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)選擇的4個(gè)瘡痂病菌模式菌株CPS-1(S.scabies)、CPS-2(S.galilaeus)、CPS-3(S.acidiscabies)和CPS-4(S.turgidiscabies)的基因組擴(kuò)增，篩選到一個(gè)通用檢測(cè)引物B1/B2，該引物對(duì)馬鈴薯瘡痂病原鏈

3、霉菌具有較高的特異性，同期測(cè)試的各非致病菌株均無(wú)目的條帶。優(yōu)化后反應(yīng)體系對(duì)各模式菌株DNA的檢測(cè)靈敏度為20 pg/μL，定量轉(zhuǎn)換為菌株孢懸液的濃度后，不同測(cè)試菌株有效檢測(cè)濃度CPS-1為2.48 CFU/μL，CPS-2為3.815 CFU/μL，CPS-3為4.035 CFU/μL，CPS-4為4.035 CFU/μL。取樣測(cè)試結(jié)果表明，該方法可用于瘡痂病菌DNA、孢懸液、瘡痂病斑組織及瘡痂病土的定性檢測(cè)，結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高。

4、>　　 2.馬鈴薯瘡痂病菌定量檢測(cè):根據(jù)通用檢測(cè)引物B1/B2擴(kuò)增獲得的核苷酸序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，篩選到符合qPCR條件的引物RTA1/RTA2，經(jīng)檢測(cè)，其在各測(cè)試菌株中的擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定，片段大小符合要求，并且無(wú)引物二聚體形成，可以作為qPCR檢測(cè)引物。分別對(duì)4種測(cè)試菌株的孢懸液進(jìn)行定量并提取DNA，稀釋至不同濃度作為模板，利用qPCR技術(shù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)土壤樣品及病組織樣品進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果表明其可對(duì)樣品進(jìn)行定量