副豬嗜血桿菌感染豬肺泡巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究與環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增法的建立.pdf

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。副豬嗜血桿菌至少有15個血清型。根據(jù)豬健康狀況和菌株毒力的高低，感染后可以造成急性或者慢性的感染。副豬嗜血桿菌感染尤其對早期斷奶的仔豬造成較大的危害。
　　 副豬嗜血桿菌的感染可通過疫苗接種和抗生素治療所控制。但是，對于疾病控制的基礎(chǔ)是能夠準(zhǔn)確的診斷出致病病原。采用細(xì)菌分離的方法來鑒定副豬嗜血桿菌存在

2、幾個缺陷，一方面是副豬嗜血桿菌對生長條件的要求較高；另一方面是，病豬可能接受過抗生素治療。因此，許多分子診斷方法已被研究和應(yīng)用。在這些檢測方法中，基于PCR技術(shù)的診斷方法能夠快速、靈敏的檢測出副豬嗜血桿菌。但是，在PCR擴(kuò)增過程中需要用到的具備精密的熱循環(huán)功能的儀器仍然妨礙PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)的恒溫擴(kuò)增法是一種新的恒溫、高效的核酸擴(kuò)增法。在本研究中，我們以副豬嗜血桿菌高度保守的16S rRNA基因為靶基因，建立了檢測副豬嗜血桿菌

3、的環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增法。
　　 天然免疫應(yīng)答是脊椎動物對抗入侵的外界微生物的第一道防線。天然免疫細(xì)胞主要包括中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。作為宿主天然免疫細(xì)胞的重要一員，巨噬細(xì)胞通過直接清除微生物和釋放相應(yīng)的細(xì)胞因子和趨化因子來聚集其它的免疫細(xì)胞到感染部位來發(fā)揮其免疫學(xué)功能。病原菌要在宿主體內(nèi)存活和繁殖，必須要突破宿主的免疫屏障。細(xì)菌的多樣性造成病原特異的巨噬細(xì)胞應(yīng)答。針對病原菌與宿主相互作用的研究能夠幫助我們理解宿主的防御策

4、略和相應(yīng)的病原菌的逃避策略。有關(guān)副豬嗜血桿菌與豬肺泡巨噬細(xì)胞的相互作用的研究已有學(xué)者報道。但是未見副豬嗜血桿菌感染豬肺泡巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答機(jī)制的報道。高通量的cDNA芯片技術(shù)為研究宿主與病原菌相互作用提供了一個有力的工具。該技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用到細(xì)胞和組織對抗病原感染的差異表達(dá)基因的分析中。在本研究中，我們應(yīng)用高通量的cDNA技術(shù)研究豬肺泡巨噬細(xì)胞在副豬嗜血桿菌感染后轉(zhuǎn)錄組的變化來揭示副豬嗜血桿菌感染引起的機(jī)體天然免疫應(yīng)答的機(jī)制。

5、>　　 1.副豬嗜血桿菌感染豬肺泡巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究
　　 應(yīng)用昂飛公司的高通量cDNA芯片，在副豬嗜血桿菌感染后6天的豬肺泡巨噬細(xì)胞中共鑒定到428個差異表達(dá)的基因。通過對這些基因進(jìn)行注釋、生物進(jìn)程分析、通路分析、相互作用分析發(fā)現(xiàn)這些基因主要屬于炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答、微管聚合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子。通路分析的結(jié)果表明，主要的通路包括：細(xì)胞吸附分子(p=3.74E-12)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(p=2.1

6、8E-10)、Toll樣受體信號通路(p=1.93E-05)和MAPK(p=7.63E-04)信號通路等。通過對屬于這些通路的差異表達(dá)基因的分析表明機(jī)體通過不同的策略激活炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答來對抗副豬嗜血桿菌的感染。特別的，許多差異表達(dá)基因與吞噬作用，吞噬溶酶體形成，細(xì)胞因子產(chǎn)生和一氧化氮產(chǎn)生等巨噬細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)功能的生物進(jìn)程相關(guān)。這些差異基因能夠幫助我們更好的理解巨噬細(xì)胞發(fā)揮其生物學(xué)功能的復(fù)雜的機(jī)制。進(jìn)一步，全部428個基因編碼的蛋白的

7、相互作用網(wǎng)絡(luò)和六個重要的子互作網(wǎng)絡(luò)用STRING和IPA預(yù)測。通過對差異表達(dá)基因編碼的蛋白的互作分析表明，大多數(shù)差異表達(dá)基因編碼的蛋白存在相互作用。但是有些差異表達(dá)基因編碼的蛋白之間可能并不存在相互作用或相互作用還沒有被發(fā)現(xiàn)。在差異表達(dá)基因中，我們發(fā)現(xiàn)coronin la，s100a4和s100a6三個基因在許多生物進(jìn)程及通路中發(fā)揮著重要的作用，提示這三個基因可能是新的副豬嗜血桿菌感染相關(guān)基因。為了研究這三個基因，我們克隆并測序了豬的c

8、oronin1a，s100a4和s100a6基因。序列上傳NCBI：coronin1a ID：[GenBank：JN092377]；s100a4 ID：[GenBank：JN122624.1]；s100a6ID：[GenBank：DQ372082.1]，這三個基因均為首次在豬中報道。對這三個基因進(jìn)化樹分析表明，豬的CORONIN1A與牛的CORONIN1A聚到一個分支上；豬的S100A6與馬的S100A6聚到一個分支上；豬的S100A4

9、與人、獼猴、黑猩猩和毛猩猩的同源性較高。對這三個基因的結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，豬的CORONIN1A在N端具有可能的Trp-Asp(WD)repeats signature，Trp-Asp(WD)repeats profile and Trp-Asp(WD)repeats circular profile等功能結(jié)構(gòu)域；豬的S100A4和S100A6具有可能的S-100calcium binding protein signature，EF-han

10、d calcium-binding domain profile等功能結(jié)構(gòu)域。我們進(jìn)一步研究了這三個基因的組織分布。結(jié)果表明豬coronin1a，s100a4和s100a6分別在胰腺，小腦，胰腺中的表達(dá)量最高。我們進(jìn)一步挑選S100A4和S100A6進(jìn)行免疫刺激實驗。實驗結(jié)果表明，s100a4和s100a6在PK-15細(xì)胞內(nèi)能夠被LPS和Poly(I：C)在48小時內(nèi)誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。另外，我們還比較了S100A4和S100A6在感染副豬嗜

11、血桿菌與正常豬的組織中的表達(dá)情況。qPCR和免疫組化結(jié)果表明S100A4和S100A6在副豬嗜血桿菌感染的豬的肺臟、脾臟和淋巴結(jié)中上調(diào)表達(dá)。證明S100A4和S100A6是兩個新鑒定到的副豬嗜血桿菌感染相關(guān)基因。
　　 2.LAMP法檢測副豬嗜血桿菌
　　 以副豬嗜血桿菌16S rRNA基因為靶基因，建立了檢測副豬嗜血桿菌的環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增法。反應(yīng)在61℃溫度下進(jìn)行，60分鐘內(nèi)能完成LAMP擴(kuò)增。結(jié)果可以通過電泳和染色進(jìn)行

12、觀察。通過對31株副豬嗜血桿菌和28株其它種屬的細(xì)菌的檢測表明，LAMP具有高度特異性，并且具有比nested PCR更高的檢測靈敏度。我們進(jìn)一步應(yīng)用LAMP、nested PCR和細(xì)菌分離對臨床樣品和人工感染樣品進(jìn)行檢測。LAMP、nested PCR和細(xì)菌分離分別用于針對55份健康豬肺臟的檢測中。結(jié)果顯示，應(yīng)用這三種檢測方法均不能在55份健康豬的肺臟中檢測到副豬嗜血桿菌。LAMP、nested PCR和細(xì)菌分離三種方法用于針對122