CTV強毒分離物對柑橘基因表達的影響及其與寄主互作蛋白的鑒定.pdf

1、柑橘是一類重要的經(jīng)濟果樹，全球年均貿(mào)易額已經(jīng)達到90億美元。由柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus，CTV)引起的柑橘衰退病被公認為柑橘栽培中最具威脅的病毒病害。病毒的成功侵染是病毒與寄主相互作用的結(jié)果，其在復制增殖過程中產(chǎn)生的病毒蛋白、核酸等分子引起寄主正常生理代謝的改變，并最終導致癥狀的產(chǎn)生。CTV侵染后能夠誘導寄主植物表現(xiàn)莖陷點、苗黃、衰退等明顯癥狀。然而，對于癥狀表現(xiàn)過程中CTV與寄主互作的分子機制仍然了解較

2、少。為了分析CTV在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平上對寄主代謝造成的影響，本研究以CTV強毒株系N21為研究對象，對CTV侵染過程中寄主基因的轉(zhuǎn)錄應答反應和部分基因的時空表達動態(tài)進行了分析，并對CTV與寄主間的互作蛋白進行了篩選。取得的主要研究結(jié)果如下:
　　 1、以感染CTV-N21并表現(xiàn)莖陷點的墨西哥梾檬以及健康梾檬植株為材料，采用抑制差減雜交技術(shù)(SSH)構(gòu)建了一個庫容量為14000個克隆的差減文庫。通過反向Southern雜交篩選，共

3、得到807個差異表達EST片段。測序及同源比對分析結(jié)果表明:這些EST片段代表430個寄主基因。其中上調(diào)表達基因282個，下調(diào)表達基因148個。使用熒光定量PCR技術(shù)對隨機挑選25個基因在感染CTV-N21墨西哥梾檬植株中的相對表達量進行的定量分析結(jié)果表明:正向文庫中14個基因上調(diào)表達倍數(shù)為1.2-10倍，而反向文庫中11個基因的下調(diào)表達倍數(shù)為1.1-7倍。以差異表達1.5倍為選擇標準，則正向和反向文庫的陽性率均在80％以上。對這430

4、個基因進行功能注釋并依據(jù)分子功能將其分為9類。其中，主要代謝和蛋白質(zhì)代謝所占比例最大，分別占基因總數(shù)的26％和15.1％。在擬南芥數(shù)據(jù)庫Tair中對這430個基因進行比對后共找到351個擬南芥同源基因。蛋白質(zhì)互作預測結(jié)果顯示這些基因編碼產(chǎn)物在擬南芥代謝中形成復雜的互作網(wǎng)絡(luò)。所占比例最大的互作來源于能量代謝。
　　 2、對6個防御以及能量代謝相關(guān)基因在墨西哥梾檬不同部位葉片組織中隨CTV侵染時間(17-177 dpi)的相對表達量

5、變化進行了分析。3個防御相關(guān)基因分別編碼幾丁質(zhì)酶(acidic classⅡ chitinase)、奇果類蛋白(miraculin-like protein)和Rsdv抗性類似蛋白(rsdvl resistance like protein);3個能量代謝相關(guān)基因編碼蛋白為:碳酸酐酶(carbonic anhydrase)、1，5-二磷酸核酮糖脫氫酶(ribulose-1，5-bisphosphatecarboxylase/oxygen

6、ase，RuBisCO)以及光捕捉復合體蛋白Lhca4(light-harvestingcomplexⅠ protein Lhca4)。熒光定量PCR分析結(jié)果顯示:這些基因的表達量隨CTV-N21侵染時間的延長表現(xiàn)出較大的波動性，在上部和下部葉片組織中的表達也存在差異。幾丁質(zhì)酶和奇果類蛋白基因均在接種后97d達到上調(diào)表達最大值。但兩者在不同部位葉片中的表達量均存在差異;Rsdv抗性類似蛋白編碼基因在上部葉片中表現(xiàn)為下調(diào)表達且呈總表達量呈

7、持續(xù)下降趨勢，而在下部葉片中則在接種后137d后表現(xiàn)為持續(xù)上調(diào)表達。光捕捉復合體蛋白編碼基因在上部和下部葉片中的誘導表達量總體均呈下降趨勢，并在接種后137d表現(xiàn)為下調(diào)表達。碳酸酐酶和RuBisCO編碼基因總體呈下調(diào)表達，兩者在不同部位葉片中的表達量存在較大差異。
　　 3、通過RT-rPCR和體外融合方法分別構(gòu)建了墨西哥梾檬和枳殼的eDNA質(zhì)粒文庫，并利用酵母雙雜交技術(shù)對CTV與寄主互作蛋白進行了篩選。初步篩選得到與病毒蛋白p

8、20和p23互作的3個寄主蛋白。其在擬南芥中的同源蛋白分別為:碳硫裂合酶(Carbon-sulfur lyases)、蛋白質(zhì)磷酸化酶(Protein phosphatase)和同源結(jié)構(gòu)域亮氨酸拉鏈家族蛋白(Homeodomain leucinezipper familyⅣ protein，HD-ZIP)。BiFC熒光觀察結(jié)果顯示:p20與HD-ZIP沿細胞壁能夠產(chǎn)生明顯的互作信號，并在部分區(qū)域大量積累呈亮斑狀。顯示其互作可能發(fā)生在胞間連