鎘經內質網應激途徑誘導雞肝細胞凋亡機制的研究.pdf

1、鎘是一種環(huán)境化學污染物，可通過水、空氣和土壤的污染在動植物體內蓄積，而肝臟是體內最初鎘積累和產生毒性部位，鎘對動物肝臟的毒性作用可引發(fā)細胞內質網應激。內質網應激已成為國外研究的熱門，但鎘對肝細胞損傷機制的研究較少，尤其是關于鎘致禽類肝細胞內質網應激誘導凋亡相關研究未見報道。
　　 本實驗應用分子生物學技術克隆內質網應激標志性蛋白葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78)基因，利用基因工程技術在原核表達系統(tǒng)中表達了GRP78蛋白并制備出了多

2、克隆抗體；而后以雞肝細胞為研究對象，在培養(yǎng)體系中分別加入終濃度0、2.5、5、10、20μmol/L氯化鎘(CdCl2)，作用24 h，通過對雞肝細胞活性、細胞凋亡、DNA損傷、細胞內游離鈣濃度、GRP78蛋白表達量及GRP78、GRP94、CaM、Bak、Bcl-2和Caspase-3 mRNA表達水平等方面的檢測，探討鎘致雞肝細胞內質網應激誘導凋亡的機理。研究結果表明：
　　 1利用原核表達載體表達融合蛋白免疫新西蘭白兔，成

3、功制備出抗雞GRP78的多克隆抗體。
　　 2應用MTT比色法首次測定了染鎘24h雞肝細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為15.59±0.89μmol/L，表明鎘對雞肝細胞有毒性作用；
　　 3倒置顯微鏡下觀察不同生長時期雞肝細胞生長情況，AO/EB雙熒光染色、DNA Ladder檢測不同濃度CdCl2對雞肝細胞的影響，結果證實CdCl2可誘導雞肝細胞發(fā)生凋亡，且凋亡具有劑量依賴性；
　　 4應用Fura-3/AM熒

4、光指示劑測定染鎘后雞肝細胞內[Ca2+]i升高，CaM基因mRNA表達量降低，鈣穩(wěn)態(tài)發(fā)生紊亂，證實鈣穩(wěn)態(tài)失衡在鎘致雞肝細胞內質網應激誘導的凋亡中起作用。
　　 5 western bolt檢測GRP78蛋白表達量，實時定量PCR法檢測GRP78和GRP94 mRNA表達量，結果證實GRP78蛋白表達量和mRNA表達量都隨染鎘劑量升高而增多，GRP94mRNA表達量也呈劑量效應關系，證實GRP78和GRP94對肝細胞的應激有保護作