產(chǎn)氣莢膜梭菌α和ε毒素蛋白高效表達(dá)體系的構(gòu)建及其免疫保護(hù)性的研究.pdf

1、產(chǎn)氣莢膜梭菌又稱魏氏梭菌(Clostridiumperfringens)是引起各種動(dòng)物腸毒血癥，壞死性腸炎和人創(chuàng)傷性氣性壞疽的主要病原菌之一。該菌分為A、B、C、D、E5型，其致病因子是菌體產(chǎn)生的外毒素。其中α和ε兩種毒素由D型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生，導(dǎo)致動(dòng)物致死性腸毒血癥，從而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 到目前為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)D型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的α和ε毒素的研究還較為少見。因此我們開展了關(guān)于這方面的研究，在本研究中，構(gòu)建能夠高效

2、表達(dá)α毒素的重組菌株和ε毒素的重組菌株；然后，分別制備包涵體粗提物，單個(gè)免疫以及共同免疫家兔，以此檢測(cè)其免疫保護(hù)性，目的在于有效防控由α和ε毒素引起的牛、羊腸毒血癥。
　　 首先D型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株在厭氧條件下培養(yǎng)復(fù)活，提取DNA模板，設(shè)計(jì)特異性引物，并對(duì)其α和ε毒素的部分基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆，以常規(guī)基因重組技術(shù)，將回收的目的基因片段插入到原核表達(dá)載體pET-28a中，得到重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定后，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿

3、菌BL21(DE3)中，IPT6誘導(dǎo)表達(dá)，摸索誘導(dǎo)最優(yōu)條件，將最佳條件下的誘導(dǎo)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并經(jīng)鎳柱親和純化目的蛋白，PBS透析，Westernblot檢測(cè)了蛋白的特異性；將純化的α和ε毒素蛋白200ug分別混以免疫弗氏佐劑免疫家兔A組和B組，α和ε毒素蛋白各100ug混以免疫弗氏佐劑共同免疫家兔C組，定期取血清并用ELISA方法檢測(cè)抗體滴度，得到α毒素、ε毒素、α和ε毒素三個(gè)抗體消長(zhǎng)規(guī)律圖譜。
　　 結(jié)果表明，

4、PCR擴(kuò)增出長(zhǎng)度為780bp的產(chǎn)物，通過(guò)Blast比對(duì)，確認(rèn)為α毒素基因；PCR擴(kuò)增出長(zhǎng)度為972bp的產(chǎn)物，通過(guò)Blast比對(duì)，確認(rèn)為ε毒素基因，表達(dá)載體pET-28a和含有目的基因的重組T載體分別雙酶切，并將酶切后的線性pET-28a回收產(chǎn)物和酶切后的目的片段回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，成功構(gòu)建了pET28a-α重組菌株和pET28a-ε重組菌株。
　　 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、SDS-PAGE電泳，獲得大小分別為28.9KD和36.

5、9KD特異的表達(dá)條帶，表達(dá)量可分別達(dá)到32.12％和32.83％，Westernblot結(jié)果表明表達(dá)的目的蛋白具有高度的特異性。以表達(dá)的α毒素蛋白的包涵體粗提物和ε毒素蛋白的包涵體粗提物分別作為抗原，二次免疫家兔后，抗血清間接ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示：經(jīng)α毒素蛋白免疫的家兔在第4周抗體效價(jià)達(dá)到最高值為5.7log2；經(jīng)ε毒素蛋白免疫的家兔在第4周抗體效價(jià)達(dá)到最高值8.7log2；經(jīng)α和ε毒素蛋白共同免疫的家兔在第6周抗體效價(jià)達(dá)到最大值為4