大豆熱激蛋白90(Hsp90)家族基因的克隆及功能初步研究.pdf

1、大豆[Glycine max(L.) Merr.]是一種重要的農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物，它對(duì)于改善人類食物結(jié)構(gòu)，滿足人類對(duì)植物蛋白和油脂的需求都具有重要的作用。然而在大豆生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中經(jīng)常會(huì)遭受高溫、高鹽、干旱等非生物脅迫的影響，造成產(chǎn)量的損失和品質(zhì)變化，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因此對(duì)大豆應(yīng)答非生物脅迫的不同機(jī)制以及他們后天獲得的脅迫抗性進(jìn)行研究具有重要的意義。逆境脅迫會(huì)導(dǎo)致生物體蛋白不正常的折疊，從而引起細(xì)胞產(chǎn)生多種問(wèn)題，因此所有物種都具有

2、專一的蛋白組裝系統(tǒng)用以維持蛋白的平衡以及減輕脅迫造成的傷害。這個(gè)系統(tǒng)的指令中心就是分子伴侶和蛋白重塑因子。這類蛋白中很多都會(huì)受到熱激的上調(diào)表達(dá)，因此這些能夠受到熱激上調(diào)表達(dá)的蛋白被稱為熱激蛋白(Heat shock protein，Hsp)，而Hsp90被認(rèn)為是這個(gè)蛋白系統(tǒng)平衡的中心。近年來(lái)很多植物的Hsp90都已被發(fā)現(xiàn)會(huì)受到逆境脅迫的的誘導(dǎo)表達(dá)，但是深入的研究并不多見(jiàn)。本論文主要針對(duì)大豆GmHsp90在非生物脅迫下的相關(guān)功能進(jìn)行了研究

3、，主要結(jié)果如下:
　　1.通過(guò)同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)大豆基因組中含有12個(gè)完整的Hsp90同源序列，并將其從大豆耐旱品種Y7F9002中全部分離。初步的生物信息分析結(jié)果表明，這12個(gè)基因分布于不同的大豆染色體上，開(kāi)放閱讀框(ORF)大小為2097-2447bp，蛋白分子量為80.13-93.56kDa。多重序列比對(duì)結(jié)果顯示12個(gè)GmHsp90蛋白具有高度的保守性，與其他物種的Hsp90相同，近N端區(qū)域都含有Hsp90家族的特征元件‘Y-x

4、-[NQHD]-[KHR]-[DE]-[IVA]F-[LM]R-[ED]'和ATP結(jié)合域。基于大豆GmHsp90序列的高度保守性以及目前對(duì)Hsp90系統(tǒng)命名的原則將這12個(gè)GmHsp90分為4個(gè)亞家族，分別命名為GmHsp90A1-A6，GmHsp90B1-B2，GmHsp90C1.1，C1.2，GmHsp90C2.1，2.2，以便于下一步的研究。
　　2.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)這12個(gè)GmHsp90基因在大豆不同組織中的表達(dá)特

5、性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，GmHsp90在大豆的根，莖，葉，花和莢中都有表達(dá)，但表達(dá)豐度各異，其中系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果中來(lái)源于同一分支的GmHsp90具有類似的表達(dá)模式。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)大豆GmHsp90基因在不同的逆境脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行研究，結(jié)果表明GmHsp90能夠迅速和劇烈的響應(yīng)熱激脅迫，特別是GmHsp90A1和GmHsp90A2。這些基因?qū)B透脅迫和鹽脅迫也都具有應(yīng)答，但是響應(yīng)速度和劇烈程度要遠(yuǎn)低于對(duì)熱激脅迫。而對(duì)這12個(gè)基

6、因進(jìn)行低溫脅迫處理后發(fā)現(xiàn)他們對(duì)短期的低溫脅迫并沒(méi)有強(qiáng)烈的應(yīng)答。從逆境脅迫表達(dá)模式研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)雖然GmHsp90As、GmHsp90Bs、GmHsp90C1s和GmHsp90C2s對(duì)熱、鹽和滲透脅迫都有應(yīng)答，但是它們的表達(dá)模式具有明顯的差異。此外，雖然歸類于GmHsp90As但是GmHsp90A1和GmHsp90A2的表達(dá)模式也明顯與其余GmHsp90A基因有差異，因此本研究進(jìn)一步將12個(gè)GmHsp90分成5種不同的類型。
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7、.通過(guò)對(duì)大豆12個(gè)GmHsp90基因進(jìn)行初步研究后，從中選擇了5個(gè)具有代表性的大豆GmHsp90（GmHsp90A2，GmHsp90A4，GmHsp90B1，GmHsp90C1.1和GmHsp90C21.1）進(jìn)行模式植物擬南芥的轉(zhuǎn)化，通過(guò)研究轉(zhuǎn)基因擬南芥在非生物脅迫下的表現(xiàn)對(duì)GmHsp90基因功能進(jìn)行進(jìn)一步的研究。對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥種子進(jìn)行高溫，鹽和滲透脅迫處理后發(fā)現(xiàn)除了GmHsp90B1轉(zhuǎn)基因株系，過(guò)表達(dá)GmHsp90的擬南芥種子的萌發(fā)率

8、顯著高于對(duì)照植株。對(duì)生長(zhǎng)3周的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進(jìn)行了高溫，鹽和滲透脅迫處理后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)GmHsp90擬南芥的在脅迫下鮮重的下降程度顯著低于對(duì)照植株。在持續(xù)高溫脅迫后對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的敗育程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株的敗育率顯著低于對(duì)照植株。這些結(jié)果說(shuō)明過(guò)表達(dá)GmHsp90基因可以降低非生物脅迫對(duì)擬南芥的傷害并且在一定程度上維持?jǐn)M南芥的生長(zhǎng)和發(fā)育。進(jìn)一步測(cè)定轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉綠素和MDA含量等生理指標(biāo)，結(jié)果表明過(guò)表達(dá)GmHsp90基因可以

9、防止植物體內(nèi)葉綠素的損失和降低MDA的含量，由于這兩個(gè)生理指標(biāo)與非生物脅迫過(guò)程中產(chǎn)生氧化脅迫密切相關(guān)，我們認(rèn)為GmHsp90基因，特別是GmHsp90A基因，在非生物脅迫下參與了降低氧化脅迫傷害的過(guò)程，以維持轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長(zhǎng)和發(fā)育。對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)脯氨酸含量檢測(cè)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)在正常條件下GmHsp90A和GmHsp90C1的轉(zhuǎn)基因植株中脯氨酸的積累發(fā)生了異常，而這種脯氨酸的異常積累可能是由于過(guò)表達(dá)GmHsp90基因擾亂了脯氨酸和P5C

10、S之間的反饋抑制平衡系統(tǒng)所導(dǎo)致的。同樣，對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行鈣離子脅迫處理后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)鈣離子的脅迫也具有一定的抗性。而這種抗性產(chǎn)生的原因，可能是過(guò)表達(dá)GmHsp90基因降低了轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)O2-等氧化脅迫相關(guān)物質(zhì)，從而一定程度上阻止鈣離子和ROS之間互作而產(chǎn)生的嚴(yán)重的氧化脅迫。
　　4.選擇轉(zhuǎn)基因擬南芥研究結(jié)果中抗性較好的GmHsp90A2進(jìn)行大豆的遺傳轉(zhuǎn)化研究。經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆整體轉(zhuǎn)化法使得GmHsp90A2在大豆

11、品種Y7F9001過(guò)表達(dá)，最終得到多個(gè)陽(yáng)性植株。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)這些轉(zhuǎn)基因株系中GmHsp90A2的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，部分株系中GmHsp90A2的表達(dá)受到了抑制，對(duì)這些株系在逆境脅迫下的葉綠素含量，MDA含量和O2-含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，這些株系受到更嚴(yán)重的氧化脅迫的傷害，對(duì)逆境脅迫的抗性也隨之降低。該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明GmHsp90A2在降低逆境脅迫下氧化脅迫對(duì)植物的傷害中確實(shí)起著重要的作用。
　　5.鑒于GmHsp90A2對(duì)非生

12、物脅迫強(qiáng)烈的應(yīng)答效果，對(duì)其啟動(dòng)子進(jìn)行了克隆研究。從GmHsp90A2的5'非翻譯區(qū)上游分離了一段3，913bp的序列。通過(guò)將該啟動(dòng)子區(qū)域與GUS基因連接，構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體并侵染洋蔥表皮細(xì)胞和擬南芥。GUS組織化學(xué)染色結(jié)果表明，該序列具有啟動(dòng)子的活性并且能夠通過(guò)轉(zhuǎn)基因方式在植物體內(nèi)行使功能，使得GUS基因在植物體內(nèi)穩(wěn)定地表達(dá)。對(duì)侵染后的洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行熱激處理并進(jìn)行GUS染色后發(fā)現(xiàn)，GmHsp90A2啟動(dòng)子能夠受到熱激脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)。初步