鴨源黃病毒的分離鑒定及生物學(xué)特性初步研究.pdf

1、2010年6月以來(lái)，我國(guó)部分地區(qū)蛋鴨養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)了一種傳染病，以產(chǎn)蛋率突然急劇下降為特點(diǎn)，剖檢發(fā)病鴨以出血性卵巢炎為共癥，并迅速在我國(guó)大部分地區(qū)蔓延，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了解引發(fā)該病的病原及其生物學(xué)特性，對(duì)安徽地區(qū)2010年流行的發(fā)病鴨進(jìn)行了病原分離及PCR檢測(cè)，并對(duì)分離毒株進(jìn)行了基因序列測(cè)定及分析，鑒定為鴨源黃病毒并命名為鴨源黃病毒AH-F10株。利用安徽分離株鴨源黃病毒AH-F10制備油乳劑滅活疫苗，并進(jìn)行免疫攻毒保護(hù)

2、試驗(yàn)，為預(yù)防和控制鴨源黃病毒病提供技術(shù)支持和保障。
　　 首先，從發(fā)病鴨病變組織進(jìn)行致病原的分離鑒定。無(wú)菌條件下采集產(chǎn)蛋下降病鴨卵巢、輸卵管等組織制成研磨液，過(guò)濾除菌。通過(guò)尿囊腔途徑接種10日齡SPF雞胚進(jìn)行病毒分離。96h內(nèi)收集尿囊液，利用RT-PCR對(duì)其進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：在pH值為7.2的條件下，雞胚分離物對(duì)1％的雞、鴨紅細(xì)胞無(wú)凝集性。RT-PCR鑒定結(jié)果表明，雞胚分離物鴨瘟病毒、鴨圓環(huán)病毒、新城疫病毒PCR呈陰性，但擴(kuò)增

3、出黃病毒NS1基因部分序列，其大小為260bp。測(cè)序結(jié)果分析表明其與黃病毒科黃病毒屬恩塔亞病毒群的巴格扎病毒(Bagaza virus)病毒具有相近的遺傳進(jìn)化關(guān)系，與國(guó)內(nèi)鴨源黃病毒核苷酸同源性達(dá)99％。由此可見(jiàn)，本次試驗(yàn)初步分離獲得了一株鴨源黃病毒，命名為鴨源黃病毒AH-F10株。證明安徽省已經(jīng)存在鴨源黃病毒的感染。
　　 其次，對(duì)分離株進(jìn)行雞胚、鴨胚的致病性試驗(yàn)。將分離得到的鴨源黃病毒AH-F10株通過(guò)尿囊腔分別接種10日齡S

4、PF雞胚(0.2ml/枚)和11日齡鴨胚(0.2ml/枚)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。雞胚傳代培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，96h內(nèi)第一代雞胚無(wú)死亡，第二代30％(3/10)雞胚死亡，第三代60％(6/10)雞胚死亡。剖檢發(fā)現(xiàn)：雞胚尿囊膜增厚，肝臟點(diǎn)狀出血，斑駁狀壞死，有的肝臟邊緣有白色壞死灶；鴨胚肝臟土黃色，腫大出血。結(jié)果表明：鴨源黃病毒AH-F10株可通過(guò)SPF雞胚和鴨胚進(jìn)行傳代培養(yǎng)，且隨著雞胚傳代次數(shù)的增加，其毒力不斷增強(qiáng)。
　　 第三，分離株對(duì)雞胚成

5、纖維細(xì)胞的致病性試驗(yàn)。取10日齡SPF雞胚，常規(guī)制作雞胚原代成纖維細(xì)胞，將分離得到的鴨源黃病毒AH-F10株接種于雞胚成纖細(xì)胞。24h時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)圓縮，48h圓縮細(xì)胞增多，72h細(xì)胞開(kāi)始脫落死亡，并且細(xì)胞折光性增強(qiáng)。結(jié)果表明鴨源黃病毒AH-F10株可以在CEF上傳代培養(yǎng)，并可以引起細(xì)胞病變。
　　 最后，鴨源黃病毒AH-F10株油乳劑滅活疫苗的制備及其免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)。利用安徽分離株鴨源黃病毒AH-F10，經(jīng)一定濃度的的甲

6、醛滅活后，與白油、司盤-80、吐溫-80，按一定的比例混合，制備成鴨源黃病毒AH-F10油乳劑滅活疫苗，并對(duì)其進(jìn)行物理性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)、安全性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果合格。免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)：28周齡產(chǎn)蛋麻鴨隨機(jī)分為四組，每組5只，分別為A免疫攻毒組、B攻毒組、C免疫組、D對(duì)照組；第1d時(shí)，A、C兩組試驗(yàn)鴨均采用頸部皮下和肌肉注射方法免疫接種鴨源黃病毒AH-F10油乳劑滅活疫苗，劑量1ml/只；B、D組以同樣的方法與劑量注射無(wú)菌生理鹽水。

7、第14d時(shí)，A、B兩組仍按上述方法接種鴨源黃病毒AH-F10病毒液，劑量為1ml/只。結(jié)果：B組在攻毒后第3d產(chǎn)蛋開(kāi)始下降，第6d攻毒組鴨停止產(chǎn)蛋，持續(xù)到第20d后又產(chǎn)蛋1枚。剖檢可見(jiàn)攻毒組鴨卵泡出現(xiàn)變性、萎縮、出血現(xiàn)象。提取卵巢、卵泡病變組織病毒RNA后，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)鴨源黃病毒結(jié)果陽(yáng)性。而A免疫攻毒組、C免疫組以及D對(duì)照組接種鴨產(chǎn)蛋及剖檢結(jié)果均正常，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果鴨源黃病毒陰性。試驗(yàn)證明，鴨源黃病毒AH-F10株油乳劑滅活