豬鏈球菌2型免疫磁珠夾心ELISA方法的建立.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcussuis，SS)是一種嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的病原，共分為33種血清型，其中與疾病最為相關(guān)的是豬鏈球菌2型(SS2)，也是臨床分離率最高的血清型。同時，豬鏈球菌還是一種重要的人畜共患病病原。病原的分離鑒定是診斷疾病和開展病原學(xué)研究的前提，經(jīng)典的方法是在分離培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，開展病原的鑒定，由于豬鏈球菌比較容易失活，導(dǎo)致病料中活細(xì)菌的數(shù)量較少，分離率較低，影響和限制了有關(guān)病原菌的深層次探索和研究。建立快速、敏感

2、和特異的檢測方法，對該病的診斷及研究具重要意義。為建立一種新型檢測方法，本實驗作了如下探索。
　　 用純化的重組MRP蛋白抗原免疫Balb/c小鼠，制備脾細(xì)胞，與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞系融合，經(jīng)間接ELISA檢測方法篩選和有限稀釋法克隆化，獲得2株能穩(wěn)定分泌抗MRP蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為7H1和3B11，抗體亞類均為IgG2bκ，誘生腹水的抗體效價均為106。間接ELISA檢測特異性表明，2株單克隆抗體與其他不同

3、血清型菌株無交叉反應(yīng);免疫印跡(westernblot)分析，只有7H1能與重組MRP蛋白和HA9801菌體均產(chǎn)生特異性蛋白條帶，而3B11只能與重組MRP蛋白產(chǎn)生特異性蛋白條帶。純化后的重組MRP蛋白純度較高，達(dá)到篩選要求。表達(dá)的MRP篩選的陽性單克隆抗體不僅可以與重組表達(dá)的MRP反應(yīng)，而且可與菌體反應(yīng)，便于今后檢測應(yīng)用。
　　 制備了純度和特異性較高的豬鏈球菌2型HA9801多克隆抗體。以豬鏈球菌2型MRP蛋白單克隆抗體為捕

4、獲抗體包被磁珠，以多克隆抗體為檢測抗體，檢測豬鏈球菌2型抗原。試驗確定單抗和多抗的最佳工作濃度分別為5μg/mL和6.25μg/mL，抗原捕獲及多抗作用時間均為30min，酶標(biāo)二抗最佳稀釋度為1∶15000，制備好的免疫磁珠保存期為5個月，最終確立了豬鏈球菌2型磁珠夾心ELISA方法。該方法特異性較高，檢測實驗室保存的存在抗原交叉性的菌株時不出現(xiàn)陽性反應(yīng)。敏感性尚可，最低可在抗原量103CFU/mL時顯示陽性反應(yīng)。對人工感染病料的檢測結(jié)