番茄黃化曲葉病毒基因沉默抑制子V2的作用方式解析.pdf

1、番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellow leaf curl virus，TYLCV)是一種煙粉虱傳播的植物病毒，分類上屬于雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金黃色花葉病毒屬(Begomovirus)，基因組為單鏈環(huán)狀DNA分子，大小約2.7kb，共編碼六個(gè)基因。其中V2(以色列分離物，TYLCV-Is)可以抑制本氏煙中35S：GFP(GFP)的局部沉默，具有基因沉默抑制子的特征。近年來TYLCV在我國(guó)肆虐危害，給我國(guó)的番茄

2、產(chǎn)業(yè)造成了慘重的損失，本論文以此為切入點(diǎn)對(duì)我國(guó)發(fā)生的TYLCV-XH2(與TYLCV-Is同源性97.95％)V2的基因沉默抑制子特征進(jìn)行了研究。
　　用pET-32a原核表達(dá)載體在大腸桿菌中表達(dá)了TYLCV-XH2 V2蛋白，以Ni+-NTA親和柱純化的重組蛋白為抗原免疫新西蘭大白兔制備了V2蛋白的多克隆抗體anti-V2，間接ELISA測(cè)定anti-V2的效價(jià)達(dá)1:655360。
　　將TYLCV編碼的基因(V1，V2，

3、C1，C2和C3)與GFP共浸潤(rùn)GFP16c本氏煙，浸潤(rùn)6天后在紫外下觀察，發(fā)現(xiàn)只有V2浸潤(rùn)區(qū)有綠色熒光，說明V2可以抑制16c本氏煙局部沉默。V2浸潤(rùn)區(qū)的綠色熒光與HC-Pro相比較弱，說明V2的局部抑制效果不強(qiáng)。而將V1，V2，C1，C2和C3這5個(gè)基因與GFP和35S：dsGFP(dsGFP)共浸潤(rùn)普通本氏煙，發(fā)現(xiàn)5個(gè)基因均不能抑制普通本氏煙上由外源dsGFP誘導(dǎo)的局部沉默。
　　將V2與GFP共浸潤(rùn)16c本氏煙，浸潤(rùn)30天

4、后紫外下觀察，發(fā)現(xiàn)16c本氏煙的系統(tǒng)葉仍有綠色熒光，說明V2具有抑制16c本氏煙系統(tǒng)沉默的功能。而將V2與GFP分別浸潤(rùn)16c本氏煙葉片的不同部位(葉基部、葉尖部)或者不同部位的葉片(上部、下部)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)V2浸潤(rùn)部位在葉基部或者下部葉片時(shí)，植株的系統(tǒng)沉默比率明顯的降低，說明V2可以抑制16c本氏煙中GFP基因沉默信號(hào)的傳導(dǎo)。
　　將構(gòu)建到PVX表達(dá)載體上的V2(pGR107-V2)浸潤(rùn)接種GFP已誘導(dǎo)沉默的16c本氏煙，浸潤(rùn)30天