龍須菜原生質(zhì)體制備、融合和再生及孢子融合的研究.pdf

1、龍須菜(Gracilaria lemaneiformis)是一種屬于紅藻門(mén)的大型海藻,是重要的經(jīng)濟(jì)海藻,是主要的瓊膠生產(chǎn)原料,它所產(chǎn)的瓊膠被廣泛用于食品、醫(yī)藥和生物工程等領(lǐng)域。至今,對(duì)龍須菜基礎(chǔ)生物學(xué)的研究已有了很多成果,闡明了遺傳、雜交、品系選育、種群結(jié)構(gòu)等機(jī)理；從70年代初開(kāi)始對(duì)龍須菜在生長(zhǎng)和瓊膠質(zhì)量等方面也進(jìn)行了深入的研究；龍須菜的大規(guī)模養(yǎng)殖逐漸從原來(lái)的北方低溫海區(qū)(渤海、黃海)擴(kuò)展到了南方高溫海區(qū)(東海和南海部分海域)。但是由于

2、目前龍須菜的栽培主要是采用營(yíng)養(yǎng)繁殖的方式,種質(zhì)退化仍是面臨的問(wèn)題,最終會(huì)阻礙龍須菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,因此采用現(xiàn)代生物技術(shù)選育生長(zhǎng)快、品質(zhì)優(yōu)、抗高溫的龍須菜新品系仍是一項(xiàng)重要的課題。
　　 植物細(xì)胞工程技術(shù)是人們較為熟知的現(xiàn)代生物技術(shù),為遺傳育種提供了有效的手段。本研究即采用了三種植物細(xì)胞工程技術(shù)對(duì)龍須菜展開(kāi)了研究,主要方法和結(jié)論如下:
　　 一.原生質(zhì)體制備與再生技術(shù)。龍須菜屬于低等藻類(lèi),其藻體結(jié)構(gòu)可簡(jiǎn)單分為基部(固著器)、莖

3、部與尖部三部分,沒(méi)有真正意義上根、莖、葉的分化,本實(shí)驗(yàn)考慮到龍須菜不同部位生理、生化特性的差異,研究不同部位原生質(zhì)體制備和再生的差異。原生質(zhì)體的制備采用酶解法,原生質(zhì)體的再生培養(yǎng)采用MES液體培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:龍須菜三個(gè)部位的最佳酶解時(shí)間、最大產(chǎn)率和原生質(zhì)體的再生能力是有差異的,莖部的最佳酶解時(shí)間最短,產(chǎn)率最高,而尖部的再生率和活力最高,最后只有尖部制備的原生質(zhì)體再生成植株。本研究對(duì)龍須菜原生質(zhì)體制備和再生差異的研究為龍須菜原生質(zhì)體

4、的再生提供了重要參考,也為能利用原生質(zhì)體融合等細(xì)胞工程技術(shù)進(jìn)行龍須菜的良種選育提供了基礎(chǔ)性研究資料。
　　 二.龍須菜細(xì)胞融合技術(shù)。本研究一是通過(guò)原生質(zhì)體融合獲得龍須菜和真江蘺(Gracilaria vermiculophylla)的體細(xì)胞雜交物種,二是通過(guò)四分孢子融合獲得兩個(gè)物種的遠(yuǎn)緣雜交物種,這兩種手段都是建立在細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁,即沒(méi)有融合屏障的前提下進(jìn)行的。基于孢子融合同樣的原理,本研究還進(jìn)行了兩個(gè)探索實(shí)驗(yàn),一是將龍須菜的四

5、分孢子(單倍體)與果孢子(二倍體)進(jìn)行融合,從而獲得三倍體孢子；二是將果孢子自融合,以期獲得四倍體孢子。研究結(jié)果顯示:PEG融合液對(duì)細(xì)胞有很大的毒性作用,原生質(zhì)體對(duì)PEG融合液的耐受性要強(qiáng)于孢子對(duì)PEG融合液的耐受性；最后只有龍須菜和真江蘺四分孢子融合后的培養(yǎng)物發(fā)育成幼苗,幼苗的顏色呈淡綠褐色,更接近于真江蘺；幼苗中有個(gè)別藻株具有生長(zhǎng)速度相對(duì)較快,分支相對(duì)較多的性狀,但是否為融合體發(fā)育而成的藻株還需后期的染色體計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。本研究為獲

6、得龍須菜與其他物種的遠(yuǎn)緣雜交產(chǎn)物提供了多種途徑,也為獲得龍須菜多倍體的研究提供了一種新思路,從而為能夠利用細(xì)胞融合等細(xì)胞工程技術(shù)進(jìn)行龍須菜的良種選育提供了基礎(chǔ)性研究資料。
　　 三.龍須菜染色體制片技術(shù)。本研究采用卡寶品紅染色-壓片法進(jìn)行龍須菜單倍體染色體數(shù)目的觀察與計(jì)數(shù)。研究結(jié)果顯示:龍須菜的細(xì)胞呈現(xiàn)多核現(xiàn)象,并且不同細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核的個(gè)數(shù)是不同的,觀察范圍內(nèi)最少的有2個(gè),最多的能達(dá)到十幾個(gè)；通過(guò)染色體計(jì)數(shù),發(fā)現(xiàn)單倍體龍須菜的染色