寡雄腐霉RCU1菌株及寡雄蛋白誘導(dǎo)番茄抗病性的研究.pdf

1、寡雄腐霉PythiumoligandrumDrechsler是一種土壤習(xí)居型腐生菌,它能在多種農(nóng)作物根圍定殖,能拮抗或寄生20多種植物病原菌,拮抗機(jī)制主要包括真菌寄生、抗生作用和誘導(dǎo)抗性等。寡雄腐霉對(duì)植物無毒性,對(duì)環(huán)境安全。寡雄蛋白(oligandrin)是寡雄腐霉產(chǎn)生的一種擬激發(fā)素蛋白,對(duì)番茄植株本身無毒性,不會(huì)引起番茄產(chǎn)生過敏性反應(yīng)壞死斑,能誘導(dǎo)番茄對(duì)多種蔬菜重要病害產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性。本文在溫室生產(chǎn)環(huán)境下,在番茄根部施用寡雄蛋白,系

2、統(tǒng)地研究了寡雄蛋白誘導(dǎo)番茄葉片對(duì)灰霉病的抗性及其機(jī)理,進(jìn)一步應(yīng)用熒光定量PCR的方法探明經(jīng)寡雄蛋白誘導(dǎo)番茄植株產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性與病程相關(guān)蛋白的關(guān)系,以及誘導(dǎo)抗性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑;并制備了寡雄蛋白的多克隆抗體,應(yīng)用免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)對(duì)寡雄蛋白在植株中的傳遞途徑、作用位點(diǎn)等進(jìn)行了亞細(xì)胞定位,主要研究結(jié)果如下:
　　 1、寡雄腐霉菌株RCU1及其分泌物的抑菌作用及對(duì)番茄灰霉病的防效
　　 應(yīng)用玻璃紙法和生長(zhǎng)速率法測(cè)定了寡雄腐霉菌

3、株RCU1分泌物對(duì)9種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果表明,該分泌物對(duì)供試的9種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)均有抑制作用;分子量小于8KD的寡雄腐霉分泌物能強(qiáng)烈抑制森禾腐霉、灰葡萄孢、黃色鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng),抑菌率分別達(dá)到88.9％、86.7％和84.6％,對(duì)供試的四種腐霉以及尖孢鐮刀菌的4個(gè)?；偷囊志示_(dá)顯著性差異。在掃描電鏡下可見,經(jīng)寡雄腐霉分泌物處理的灰葡萄孢,菌絲細(xì)胞破裂、穿孔、干癟,且菌絲分化出的分生孢子梗少,產(chǎn)孢量明顯下降。溫

4、室盆栽試驗(yàn)表明,寡雄腐霉濾液對(duì)番茄灰霉病具有顯著的預(yù)防保護(hù)作用和治療作用,其預(yù)防保護(hù)作用與殺菌劑50％多菌靈可濕性粉劑1000倍液的防治效果達(dá)到同一顯著水平。
　　 2、寡雄蛋白誘導(dǎo)番茄苗對(duì)灰霉病的抗性及機(jī)理研究
　　 溫室盆栽實(shí)驗(yàn)表明,寡雄蛋白(10μg/mL)處理番茄苗根系能夠誘導(dǎo)番茄葉片對(duì)灰霉病的抗性,誘抗效果對(duì)供試品種合作903和凱特2號(hào)無顯著差異。寡雄蛋白番茄根部誘導(dǎo)24h后接種灰葡萄孢,保護(hù)作用達(dá)61.3％,

5、治療效果可達(dá)51.8％;應(yīng)用熒光定量PCR的方法研究了寡雄蛋白對(duì)番茄葉片基因表達(dá)量的影響,結(jié)果表明,寡雄蛋白根部處理24h,誘導(dǎo)番茄葉片病程相關(guān)蛋白幾丁質(zhì)酶和-β-1,3葡聚糖酶基因表達(dá)量分別比對(duì)照增強(qiáng)4.7倍和3.1倍。
　　 寡雄蛋白處理番茄根系24h后接種灰葡萄孢,處理后3d及5d木質(zhì)素含量比接種灰葡萄孢對(duì)照分別升高18.5％和34.4％(合作903),22.3％和27.6％(凱特2號(hào));番茄葉片POD、PPO、PAL活性

6、均明顯高于接種灰葡萄孢對(duì)照,峰值較對(duì)照高20.0％,32.6％,57.1％(合作903),43.9％、32.6％、41.5％(凱特2號(hào))。誘導(dǎo)番茄植株防御酶活性的提高,調(diào)控體內(nèi)次生物質(zhì)代謝,誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白基因表達(dá)量的上調(diào),可能是寡雄蛋白誘導(dǎo)番茄葉片抵御灰霉病的主要機(jī)理。
　　 3、寡雄蛋白誘導(dǎo)番茄抗灰霉病的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
　　 應(yīng)用熒光定量PCR的方法研究了寡雄蛋白對(duì)番茄葉片的基因表達(dá)量的影響,結(jié)果表明,寡雄蛋白根部處理

7、可誘導(dǎo)番茄葉片乙烯反應(yīng)因子ERF2和茉莉酸(JA)相關(guān)因子PR6基因表達(dá)量分別比對(duì)照增強(qiáng)6.6倍和3.6倍,寡雄蛋白誘導(dǎo)對(duì)番茄灰霉病的系統(tǒng)抗性依賴于ISR中的JA和ET信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑;寡雄蛋白根部處理24h,誘導(dǎo)番茄葉片病程相關(guān)蛋白幾丁質(zhì)酶和β-1,3葡聚糖酶基因表達(dá)量分別比對(duì)照增強(qiáng)4.7倍和3.1倍,表明寡雄蛋白誘導(dǎo)番茄對(duì)灰霉病的抗性同時(shí)具有ISR和SAR的部分特征。寡雄蛋白可能是通過水楊酸(SA)協(xié)同JA/乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)番茄對(duì)灰

8、霉病的抗性。
　　 4、寡雄蛋白誘導(dǎo)番茄果實(shí)對(duì)灰霉病的抗性及機(jī)理研究
　　 寡雄蛋白(10μg/mL)處理番茄果蒂處24h后在番茄果肩處接種灰葡萄孢,常溫下寡雄蛋白處理的番茄果實(shí)腐爛率比對(duì)照降低了49.5％。常溫貯藏結(jié)束時(shí),寡雄蛋白處理番茄的細(xì)胞質(zhì)膜相對(duì)透性比對(duì)照低63％;MDA產(chǎn)生量比對(duì)照降低31％。寡雄蛋白處理番茄果實(shí)PAL、PPO和POD活性峰值比接種處理高18.8％,20.0％和22.7％。應(yīng)用熒光定量PCR的方

9、法研究了寡雄蛋白對(duì)番茄果實(shí)基因表達(dá)量的影響,結(jié)果表明,寡雄蛋白處理的番茄果實(shí)PR-2a和PR-3a基因表達(dá)量比對(duì)照升高2.7倍和3.6倍。誘導(dǎo)番茄防御酶活性的提高,維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性,誘導(dǎo)PR-2a和PR-3a基因表達(dá)量的升高,是寡雄蛋白誘導(dǎo)番茄果實(shí)抵御灰霉病的關(guān)鍵。
　　 5、寡雄蛋白與寄主植物互作的細(xì)胞化學(xué)定位
　　 制備了寡雄蛋白的多克隆抗體,應(yīng)用免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)對(duì)寡雄蛋白在寡雄腐霉菌絲中、寡雄腐霉在番茄根部定

10、殖以及寡雄蛋白在番茄葉片中的移動(dòng)進(jìn)行亞細(xì)胞定位,結(jié)果表明,PDA平板或液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的寡雄腐霉菌絲中,寡雄蛋白主要積累在菌絲細(xì)胞壁,可以分泌到寡雄腐霉細(xì)胞外,表明寡雄蛋白是一種外泌蛋白。
　　 免疫膠體金標(biāo)記結(jié)果表明,寡雄腐霉在番茄根部定殖4h即可在番茄根部細(xì)胞中檢測(cè)到寡雄蛋白,隨著時(shí)間的推移,寡雄蛋白的量逐漸增加,在根組織細(xì)胞的細(xì)胞壁、葉綠體等處聚集。菌絲中合成的寡雄蛋白主要束縛在菌絲壁上,而菌絲內(nèi)部較少,說明寡雄蛋白合成后

11、很快分泌出去,而不是在成熟的菌絲中積累。寡雄腐霉接種24h即可在番茄根組織細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到大量寡雄蛋白,表明番茄是寡雄腐霉的適宜寄主,寡雄腐霉可以大量在番茄根部定殖,分泌寡雄蛋白誘導(dǎo)番茄系統(tǒng)獲得抗性。
　　 寡雄蛋白處理番茄中部葉片,免疫膠體金標(biāo)記結(jié)果表明,4h后番茄上、中、下部葉片細(xì)胞壁和細(xì)胞核中均有大量寡雄蛋白存在,表明寡雄蛋白可在植物體內(nèi)進(jìn)行上下轉(zhuǎn)運(yùn)。寡雄蛋白可能是從侵入部位傳導(dǎo)到植物其他部位并激發(fā)系統(tǒng)獲得抗性反應(yīng)的信號(hào),其信