豬α干擾素和白細(xì)胞介素-2在真核細(xì)胞中表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物活性分析.pdf

1、目的：α干擾素（interferon-α）是一種具有廣譜抗病毒、抗腫瘤及免疫激活功能的細(xì)胞因子，白細(xì)胞介素2在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及感染性疾病的治療中也具有重要作用，同時(shí)它還能激活B淋巴細(xì)胞，參與機(jī)體的體液免疫應(yīng)答，促進(jìn)抗體分泌，增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答。
　　 Mx蛋白是Ⅰ型和Ⅲ型干擾素(IFN)誘導(dǎo)細(xì)胞后產(chǎn)生的天然抗病毒蛋白，有很好抗病毒活性，且副作用小。本實(shí)驗(yàn)將豬α干擾素基因和白細(xì)胞介素2基因分別轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，檢測(cè)這兩個(gè)基因的表達(dá)，及

2、表達(dá)產(chǎn)物的抗病毒活性。為將這兩個(gè)基因用于疫苗佐劑及轉(zhuǎn)基因抗病育種動(dòng)物奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)也克隆了豬Mx1基因啟動(dòng)子及Mx1基因，并構(gòu)建了真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究豬Mx1基因奠定了基礎(chǔ)。
　　 方法：⑴根據(jù)已發(fā)表的豬IFN-α和豬IL-2基因的核酸序列設(shè)計(jì)引物，克隆出這兩個(gè)基因，鑒定正確后將兩個(gè)基因分別連到pcDNA3.1載體上構(gòu)建真核表達(dá)載體，分別命名為pcDNA3.1-IFN、pcDNA3.1-IL；⑵用構(gòu)建好的真核表達(dá)載體分別

3、轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞通過G418篩選出轉(zhuǎn)染外源基因的細(xì)胞，并用RT-PCR進(jìn)一步檢測(cè)是否整合外源基因；⑶采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)豬IFN-α和IL-2基因在真核細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)水平、采用ELISA方法檢測(cè)豬IFN-α和IL-2基因在真核細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平、采用淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)測(cè)豬IFN-α和IL-2基因在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性。(4)根據(jù)Genbank已公布的豬Mx1基因啟動(dòng)子、Mx1基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)合成兩對(duì)特異引物分別擴(kuò)增了豬M

4、x1基因啟動(dòng)子和Mx1基因，并將這兩個(gè)基因亞克隆到含有G418篩選標(biāo)記的PGKneotpALox2真核表達(dá)載體上。
　　 結(jié)果：⑴成功克隆了豬IFN-α和豬IL-2基因，經(jīng)測(cè)序鑒定正確，并將其分別連到pcDNA3.1真核表達(dá)載體上，構(gòu)建成功pcDNA3.1-IFN、pcDNA3.1-IL轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。⑵通過G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)豬IFN-α和豬IL-2基因的真核細(xì)胞，經(jīng)RT-PCR 鑒定為陽(yáng)性。⑶實(shí)時(shí)定量PCR表明轉(zhuǎn)入豬IFN-α基

5、因的真核細(xì)胞其IFN-α mRNA表達(dá)量高于陰性未轉(zhuǎn)染組1.52倍，轉(zhuǎn)入豬IL-2基因的真核細(xì)胞其IL-2 mRNA表達(dá)量高于陰性未轉(zhuǎn)染組1.43倍；對(duì)整合外源基因真核細(xì)胞上清液ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，豬IFN-α的含量為121.45pg/mL，而未轉(zhuǎn)染該基因的對(duì)照組含量為89.36 pg/mL 轉(zhuǎn)染組高于對(duì)照組1.35倍。豬IL-2的含量為 97.45pg/mL，而未轉(zhuǎn)染對(duì)照組含量為75.36 pg/mL 轉(zhuǎn)染組高于對(duì)照組1.29倍；

6、經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析表明整合外源基因的真核細(xì)胞上清液淋巴細(xì)胞增殖作用與陰性對(duì)照組相比均差異顯著，表明這兩個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物有很好的活性，可以用來抗病毒。(4)成功克隆了豬Mx1基因啟動(dòng)子和Mx1基因并將這兩個(gè)基因亞克隆到PGKneotpALox2真核表達(dá)載體上。
　　 結(jié)論： 豬IFN-α和豬IL-2基因可以在真核細(xì)胞中很好表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物具有很好的活性，為開發(fā)新型基因工程疫苗佐劑和轉(zhuǎn)基因抗病動(dòng)物奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)也構(gòu)建了豬