棉花黃萎病抗菌肽基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、由大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的黃萎病是棉花的主要病害之一,它嚴(yán)重影響了棉花的生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)室武翠紅碩士分離篩選出了一株對大麗輪枝菌有較強(qiáng)抗菌活性的新菌株一解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)RS-25,對此菌株的蛋白進(jìn)行了分離純化,得到表觀分子量為9 kD的單一活性組分,命名為A2,EDMAN降解法測得其N端序列為ASGGTVGIYGANMRS。本論文在此工作基

2、礎(chǔ)上進(jìn)行后續(xù)研究,重點(diǎn)研究了棉花黃萎病抗菌肽全長基因和成熟肽基因的克隆及在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達(dá)。
　　 將A2的N端15個(gè)氨基酸在NCBI上進(jìn)行比對,結(jié)合菌株的16S rDNA結(jié)果,得到一段100％同源蛋白序列。根據(jù)此同源蛋白對應(yīng)的編碼序列對新型抗菌肽全長基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì),構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a-a2q1,并對其進(jìn)行了測序。結(jié)果表明:此抗菌肽基因a2q1全長354 bp,編碼117個(gè)氨基酸,其中第42～56位氨基酸與武

3、分離純化的抗菌肽A2的N端15個(gè)氨基酸完全相同。本研究得到的蛋白在N端比抗菌肽A2多出41個(gè)氨基酸,分析這41個(gè)氨基酸可能起調(diào)控作用,而武分離純化的抗菌肽A2為成熟肽。將重組質(zhì)粒pET-30a-a2q1利用熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,IPTG誘導(dǎo)后,SDS-PAGE顯示胞內(nèi)具有目的條帶,表達(dá)產(chǎn)物表觀分子量為19 kD。用鎳柱親和層析的方法對表達(dá)蛋白進(jìn)行純化,SDS-PAGE顯示在19 kD有單一條帶。大麗輪枝菌抑菌試驗(yàn)檢測,發(fā)現(xiàn)其無

4、抑菌活性。本研究克隆表達(dá)的目的蛋白A2Q1比武分離純化的抗菌肽A2多41個(gè)氨基酸,為驗(yàn)證是否是此41個(gè)氨基酸影響蛋白活性,以及獲得具有抗菌活性的重組蛋白,對成熟肽片段進(jìn)行了研究。
　　 對成熟肽基因設(shè)計(jì)引物,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a-a2c,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá),鎳柱親和層析,SDS-PAGE顯示在14 kD有單一條帶,由于成熟肽A2C與載體His標(biāo)簽融合,故表觀分子量比武分離純化的抗菌肽A2(9 kD)略大。經(jīng)檢

5、測,發(fā)現(xiàn)A2C也無抑菌活性。綜上分析可能是由于抗菌肽A2為糖蛋白(武報(bào)道),而大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)缺乏糖基化功能,所以表達(dá)的蛋白A2Q1、A2C沒有活性。
　　 酵母表達(dá)系統(tǒng)具有糖基化功能,故選取畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行以下研究。對全長基因設(shè)計(jì)引物(引入組氨酸標(biāo)簽),構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-a2q2,線性化后,用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,經(jīng)甲醇低溫誘導(dǎo),鎳柱親和層析,SDS-PAGE顯示在19 kD有單一條帶。經(jīng)檢測,發(fā)現(xiàn)表達(dá)