香雪蘭UDP-葡萄糖：類(lèi)黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及其功能鑒定.pdf

1、香雪蘭(Fressia hybrida)，鳶尾科香雪蘭屬多年生球根草本花卉，原產(chǎn)非洲南部好望角，現(xiàn)廣為栽培，是世界十大名貴切花之一，主要用于盆栽和切花生產(chǎn)。目前，香雪蘭約有500種園藝品種，在生產(chǎn)上常根據(jù)花色分為紅色系、黃色系、白色系、藍(lán)色系等栽培品系，由于香雪蘭花色艷麗且豐富，是進(jìn)行植物花色研究的理想材料。
　　在植物花色形成過(guò)程中，UDP-葡萄糖:類(lèi)黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UF3GT)通常作用于花色苷合成途徑的最后一步，其

2、能夠催化UDP-葡萄糖中的糖分子轉(zhuǎn)移到花色素的3’羥基位點(diǎn)上，將花色素轉(zhuǎn)化生成穩(wěn)定的花色苷，該催化步驟對(duì)花色素的穩(wěn)定性及其在液泡中的溶解性至關(guān)重要。
　　本論文以香雪蘭UF3GT作為研究對(duì)象，進(jìn)行基因克隆，并對(duì)該基因的功能進(jìn)行研究，初步探討了UF3GT與花色形成之間的關(guān)系，為利用基因工程方法改良植物花色奠定基礎(chǔ)。主要研究方法與結(jié)果如下:
　　1.通過(guò)cDNA文庫(kù)篩選和3'RACE的方法克隆得到香雪蘭UF3GT基因的全長(zhǎng)cDN

3、A序列。序列分析表明，該cDNA序列長(zhǎng)為1614bp，其中開(kāi)放閱讀框架長(zhǎng)1338bp，編碼的蛋白序列長(zhǎng)為445個(gè)氨基酸，推測(cè)蛋白質(zhì)的分子量是48，043Da，等電點(diǎn)為6.02，命名為Fh3GT1(Genbank登錄號(hào):HM590645)。通過(guò)Fh3GT1氨基酸的同源性和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明:該基因是UF3GT基因家族中的一個(gè)新成員。
　　2.利用半定量RT-PCR方法分析在紅花香雪蘭的不同開(kāi)花階段、不同器官以及不同花色品種中Fh3G

4、T1基因的表達(dá)情況。Fh3GT1基因在紅花香雪蘭的花、莖、葉中均有表達(dá)，當(dāng)香雪蘭花瓣處于完全開(kāi)放階段時(shí)，F(xiàn)h3GT1基因的表達(dá)量達(dá)到最高;在不同花色香雪蘭品種中，該基因在紅花和粉花香雪蘭的花瓣中表達(dá)最高，黃花香雪蘭次之，而在白花香雪蘭中表達(dá)量最低。
　　3.構(gòu)建Fh3GT1基因的重組原核表達(dá)載體(pET-Fh3GT1)，并在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中誘導(dǎo)蛋白的體外表達(dá)并進(jìn)行酶活檢測(cè)。SDS-PAGE電泳分析顯示重組蛋白分子量

5、約為48 kDa，與預(yù)測(cè)的該基因編碼蛋白的分子量相同。體外酶活檢測(cè)反應(yīng)顯示反應(yīng)產(chǎn)物中有花色苷的生成，說(shuō)明原核表達(dá)制備的Fh3GT1蛋白具有糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，初步證明克隆得到的基因是UDP-葡萄糖:類(lèi)黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因。
　　4.構(gòu)建Fh3GT1::GFP融合表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌侵染法在洋蔥(Allium cepa)表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)Fh3GT1::GFP融合蛋白。對(duì)Fh3GT1進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，該蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)

6、中，屬于胞質(zhì)蛋白。
　　5.構(gòu)建pBI-Fh3GT1雙元表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化矮牽牛，過(guò)量表達(dá)Fh3GT1基因，驗(yàn)證其生物學(xué)功能。結(jié)果統(tǒng)計(jì)，共得到轉(zhuǎn)基因矮牽牛植株7株，通過(guò)PCR和Southern雜交鑒定，表明外源基因基因成功整合到轉(zhuǎn)基因矮牽牛植株的基因組中。得到含有單拷貝Fh3GT1基因的轉(zhuǎn)基因紅花矮牽牛5株，其總花色苷含量平均下降40％，花瓣邊緣出現(xiàn)白斑和顏色缺失;得到含有二個(gè)拷貝Fh3GT1基因的轉(zhuǎn)基因矮牽牛2株，總

7、花色苷含量平均下降80％，花色從紅色變成深粉色。
　　6.構(gòu)建pART-Fh3GT1i干擾表達(dá)載體，選擇Fh3GT1基因序列中3’端保守區(qū)的一段長(zhǎng)為347 bp的片段作為靶基因，構(gòu)建含有內(nèi)含子的發(fā)卡RNA(hpRNA)結(jié)構(gòu)，利用RNAi原理干擾矮牽牛內(nèi)源UF3GT基因的表達(dá)，為研究Fh3GT1基因的功能奠定基礎(chǔ)。結(jié)果統(tǒng)計(jì)，共得到轉(zhuǎn)基因矮牽牛植株5株，通過(guò)PCR和Southern雜交鑒定，表明外源基因基因成功整合到轉(zhuǎn)基因矮牽牛植株的