禾谷鐮刀菌致病相關(guān)基因的鑒定及其毒素DON特異親和肽段的淘選.pdf

1、由禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)引起的赤霉病((Fusarium Head Blight)是世界性流行病害，危害小麥、大麥、玉米的生產(chǎn)。該病害的流行不僅造成作物的嚴重減產(chǎn)、品質(zhì)降低，而且導致受侵染籽粒中含有真菌毒素，危害食品安全和人畜健康。
　　 禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)是單端孢霉烯族化合物中的一種，主要污染小麥、玉米等谷物及其制品。DON毒素對的谷物污染嚴重，在收割季節(jié)如雨量偏多則D

2、ON的污染更為嚴重。DON毒素不僅具有生殖毒性、免疫毒性和致動物嘔吐等急性毒性，而且與人的癌癥的誘發(fā)相關(guān)。
　　 本研究圍繞禾谷鐮刀菌展開，共分兩部分，第一部分旨在鑒定同禾谷鐮刀菌致病性相關(guān)的基因，進一步探明禾谷鐮刀菌的致病機制；第二部分旨在通過淘選同毒禾谷鐮刀菌素DON特異親和的肽段，達到簡化DON毒素檢測方法的目的。
　　 本研究以突變體庫中經(jīng)初次鑒定為致病力變異菌株的10個突變體菌株和野生型菌株為材料，圍繞致病相關(guān)

3、基因的鑒定，首先通過人工接種方法在抗赤性不同的小麥品種中淘選出具有顯著致病力變異的突變體菌株，進而利用綠色熒光蛋白標記比較致病力變異菌株同野生型菌株在致病進程上的差異，觀察突變基因?qū)曛虏×Φ挠绊懛绞?，最后利用TAIL-PCR技術(shù)鑒定出菌株中發(fā)生插入突變的基因。結(jié)果表明，突變菌株G12在三個小麥品種中的致病力明顯增強，且同初次鑒定結(jié)果相符。通過綠色熒光蛋白標記觀察致病進程表明，突變體G12對穗軸的侵染更早，在穗軸中的熒光信號更強。TA

4、IL-PCR對突變體插入位點側(cè)翼序列進行擴增結(jié)果表明，突變體G12的轉(zhuǎn)座子插入位點位于一個未知基因FGSG_04134.3的編碼區(qū)內(nèi)，蛋白結(jié)構(gòu)域分析表明該蛋白含有一個C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，同源性分析表明，該基因編碼的氨基酸序列同煙曲霉和稻瘟病菌的con7p轉(zhuǎn)錄因子同源性達53％。推測突變基因可能是同禾谷鐮刀菌致病性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，并以負調(diào)控的方式影響致病相關(guān)基因的表達。該基因的具體功能有待進一步研究。
　　 為了建立針對DON毒素

5、的更加簡便的檢測方法，本研究在制備DON人工抗原的基礎(chǔ)上，從噬菌體隨機七肽庫中淘選DON的特異親合肽段，并通過競爭性ELISA對淘選到的肽段加以驗證。人工抗原合成結(jié)果表明：采用丁基硼酸封閉法制備的DON人工抗原的適合噬菌體的淘選要求，TLC檢測表明人工抗原合成成功；親和肽段淘選結(jié)果表明：經(jīng)過四輪淘選，噬菌體出現(xiàn)富集現(xiàn)象，ELISA檢測陽性克隆并測序，結(jié)果表明，淘選到得陽性噬菌體氨基酸序列為MAPGWVP。競爭性ELISA檢測表明，該肽段